Медиатека

28.09.2022

ПЦР: новые решения и будущее известного метода

Не так давно мы уже познакомили наших читателей с основами классической полимеразной цепной реакции (ПЦР). С момента возникновения этой технологии прошло почти 40 лет. Всё это время наука и медицина не стояли на месте, а вместе с ними менялся и метод ПЦР (Рис. 1). В современных лабораториях вы можете встретить множество модификаций этого подхода, адаптированных для решения конкретных задач. О некоторых современных решениях и пойдет речь в этой статье.

Рис. 1. Ключевые этапы развития ПЦР-технологии.
Источник >>

Опуская подробности, с которыми вы можете ознакомиться в первой части нашего обзора про ПЦР, напомним, что ПЦР — это технология, позволяющая амплифицировать, то есть многократно умножать количество определенного ДНК-фрагмента. Фрагмент, который нужно амплифицировать, задаётся с помощью праймеров — коротких нуклеотидных последовательностей, которые инициируют синтез ДНК и тем самым ограничивают нужный фрагмент. В классическом случае для проведения ПЦР смесь, содержащую ДНК с амплифицируемым фрагментом, праймеры и другие необходимые компоненты помещают в особый прибор — амплификатор. В нём обеспечивается поддержание температурных условий, оптимальных для синтеза искомого участка ДНК. С каждым циклом число этих участков удваивается. Полученные в результате реакции продукты разделяют с помощью гель-электрофореза и визуализируют, чтобы определить наличие или отсутствие искомого участка.

Количественная ПЦР, или ПЦР в реальном времени

Классический метод ПЦР хорошо подходит, когда необходимо получить однозначный ответ на вопрос — встречается ли данная ДНК-последовательность в образце? Например, когда проводят ПЦР-тест на коронавирус, то наличие коронавирус-специфичного генетического материала в пробе пациента будет надежным подтверждением диагноза. Такой метод ПЦР называется качественным, потому что он говорит «да» или «нет», но ничего — о количестве вещества в исходном образце.

Между тем, для многих задач, например, для оценки эффективности заражения клеток вирусным вектором или выявления соотношения разных типов бактерий в микробиоте, необходимо иметь представление о количестве молекул с заданной последовательностью в исходном образце. Определить его помогает особая разновидность ПЦР — количественная ПЦР, или ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ). Этот метод основан на автоматическом детектировании ДНК по завершении каждого цикла прямо в процессе амплификации либо с помощью флуоресцентных красителей, неспецифично встраивающихся между двумя нитями ДНК, либо посредством связывания с флуоресцентно-меченными олигонуклеотидами (Рис. 2). ПЦР-РВ была разработана группой американских исследователей во главе с Расселом Хигучи в 1992 году ¹. Они добавили к ПЦР-смеси бромистый этидий — флуоресцентный краситель, который встраивается в двуцепочечную ДНК и испускает свечение под действием ультрафиолета. В результате накопление ДНК сопровождалось усилением свечения, которое росло с каждым циклом и позволяло произвести количественную оценку генетического материала в исходной смеси ².

На сегодняшний день наиболее широко используемый неспецифический краситель — SYBR Green I (Рис. 2, слева). Его эффективность связывания с двуцепочечной ДНК в 100 раз выше, чем у бромистого этидия. При встраивании в ДНК интенсивность флуоресценции SYBR Green I увеличивается более чем в 1000 раз ³, поэтому этот краситель отлично подходит для детектирования встроенными фотодатчиками современных ПЦР-систем.

Рис. 2. Принцип работы флуоресцентных красителей на примере SYBR Green I (слева) и флуоресцентно-меченных олигонуклеотидов на примере TaqMan (справа).
Источник >>

Оценка количества молекул исходного образца методом ПЦР-РВ производится на основе графика амплификации (Рис. 3), который отражает изменение интенсивности флуоресценции от числа циклов. По графику рассчитывают коэффициент Ct — он показывает сколько ПЦР-циклов необходимо, чтобы флуоресцентный сигнал превысил пороговый уровень шума. Чем меньше Ct, тем больше генетического материала с амплифицируемым фрагментом было в исходной пробе. Для расчета количества молекул мишени в исходной пробе используют калибровочную кривую — кривую амплификации для образца с уже известным количеством вещества. Число молекул целевой ДНК в первоначальном образце оценивают относительно этого стандартного образца, поэтому такая оценка является относительной ⁴.

Рис. 3. Схематичное изображение стандартных кривых, используемых для оценки исходного количества исследуемого генетического материала в ПЦР-РВ. Каждая кривая отражает амплификацию ДНК-фрагментов одного типа. Кривая с наименьшим Ct соответствует наибольшему числу молекул в исходном образце (10000 молекул). Ct — пороговое число циклов; может быть дробным.
Источник >>

ПЦР-РВ не требует извлечения продуктов реакции для их визуализации, как это происходит в классической ПЦР, поэтому этот подход позволяет получить более точный и надёжный результат. А благодаря постоянному совершенствованию технического и программного обеспечения, относительно низкой себестоимости и появлению все новых модификаций ПЦР, которые можно комбинировать с ПЦР-РВ, этот подход приобрел исключительную популярность для обнаружения патогенов, анализа состава продуктов питания, оценки соотношения биологических компонентов в смеси и многих других задач ²^, ⁵.

Цифровая ПЦР

Детектировать и оценить количество искомого образца методом ПЦР-РВ можно только если число копий в пробе не менее ~10-100 ⁶^, ⁷. Однако эффективная характеристика генетических и эпигенетических изменений в онкологии, вирусологии или пренатальной диагностике требует еще более точных решений, ведь цена промедления или ошибки — человеческая жизнь.

Развитие микрофлюидных технологий и устройств «лаборатория-на-чипе» способствовало созданию цифровой ПЦР (цПЦР) ⁸^, ⁹ — усовершенствованной ПЦР-технологии, которая отлично подходит для исследований, требующих исключительно высокой чувствительности и надежности. На сегодняшний день метод цПЦР — наиболее высокоточная разновидность ПЦР (Рис. 1). Он позволяет обнаружить даже одну молекулу нуклеиновой кислоты в пробе!

Благодаря своей исключительной чувствительности и специфичности в сочетании с возможностью проводить количественный анализ для разных типов биологических образцов цПЦР — это уникальный подход для исследования рака. Опухолевые клетки отличаются от здоровых множеством аномалий в генетическом материале и метаболизме, которые могут служить надежными маркерами для диагностики и оценки эффективности выбранной терапии. цПЦР — незаменимое решение для детектирования редких мутаций (Рис. 4) и продуктов обмена клеток раковой опухоли благодаря способности выявлять даже самые редкие молекулы в клиническом образце ⁷^, ⁸.

Рис. 4. Благодаря усовершенствованному подходу, цПЦР — в отличие от классической ПЦР и ПЦР-РВ — позволяет обнаружить даже одну молекулу в образце. ⁸

Технология цПЦР используется и как высокоточное решение для диагностики новой коронавирусной инфекции COVID-19. В то время как средняя точность стандартного теста на COVID-19 методом ПЦР-РВ составляет 68-78% (при взятии мазка из полости носа/глотки ¹⁰), она резко снижается при низкой вирусной нагрузке, — например, до проявления симптомов коронавируса или уже на стадии выздоровления. Недостаток чувствительности сказывается на эпидемиологической обстановке, ведь рост числа ложноотрицательных тестов задерживает постановку диагноза и начало лечения или ведет к преждевременной выписке, подвергая риску контактирующих с пациентом людей. Именно поэтому тест-системы на основе цПЦР набирают все большую популярность ¹¹^, ¹². Помимо COVID-19, цПЦР также показал более высокую в сравнении с другими подходами эффективность в диагностике особо опасных для человека вирусных инфекций, таких как вирусы гепатита В, иммунодефицита человека и папилломы человека ¹¹^, ¹³.

Принцип цПЦР основывается на разделении содержащего амплифицируемый фрагмент образца на тысячи или даже миллион отдельных фракций (например, капель), в каждой из которых в идеале оказывается одна или ни одной молекулы нуклеиновой кислоты. Затем в каждой из фракций одновременно проводят ПЦР ⁹. В результате метод цПЦР позволяет провести сразу тысячи микрореакций для одного образца. Другое важное отличие цПЦР от ПЦР-РВ заключается в том, что метод не требует построения стандартных кривых ПЦР (Рис. 3), а расчет количества молекул вещества в исходном образце производится из предположения о том, что в каждой фракции, изначально содержавшей молекулу искомого вещества, будет детектирован флуоресцентный сигнал, а во всех других — нет ¹⁴ (Рис. 5). Благодаря такому подходу метод цПЦР позволяет проводить абсолютную количественную оценку мишени и детектировать даже единичные молекулы в образце. А, поскольку эффективность реакции оказывает меньшее влияние на качество данных, цПЦР менее чувствительна к наличию ингибиторов реакции в образе ¹¹.

Если после разделения образца на фракции в каждой их них оказывается либо одна, либо ни одной молекулы-мишени, оценить число молекул в исходной пробе можно просто посчитав число «положительных» фракций. Но что если в одной капле на самом деле находится больше одной молекулы? Скорректировать расчеты и получить достоверный результат помогают стандартные статистические подходы. Распределение молекул по фракциям цПЦР следует распределению Пуассона. Согласно этой модели, чем больше число «положительных» капель, тем больше вероятность, что в каждой капле содержится более одной молекулы-мишени. На основе числа «отрицательных» фракций модель Пуассона предсказывает вероятность нахождения в «положительных» фракциях одной и более копий. В результате использование модели Пуассона для аппроксимации числа целевых молекул в исходной пробе позволяет получить достоверный результат даже при не оптимальном разделении образца.

Рис. 5. Этапы проведения эксперимента с использованием автоматической капельной цПЦР-системы от RainSure.
Источник 1 >>; Источник 2 >>; Источник 3 >>; Источник 4 >>; Источник 5 >>

Некоторые другие ПЦР-подходы

ПЦР-РВ и цПЦР часто комбинируют с другими ПЦР-подходами. На сегодняшний день таких подходов, позволяющих решать конкретные исследовательские и медицинские задачи, огромное количество. Ниже мы расскажем о трех крайне перспективных решениях, которые широко применяются уже сейчас.

Один из часто используемых подходов — ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). ОТ-ПЦР позволяет амплифицировать выбранный фрагмент РНК путем синтеза комплементарной ему одноцепочечной ДНК с помощью фермента обратной транскриптазы. Затем, уже в ходе ПЦР, одноцепочечная ДНК достраивается до двуцепочечной (Рис. 6А). Этот подход широко используется для диагностики инфицирования РНК-содержащими вирусами, у которых генетический материал вместо ДНК представлен РНК (коронавирус, вирус гриппа, вирус иммунодефицита человека и др.) ¹⁹.

Но что делать, если потенциальных кандидатов-возбудителей инфекции много, а действовать надо срочно? Например, если у пациента развивается сепсис, и счет идет на часы, точно и быстро определить причину инфекции — жизненно необходимо ²⁰. Для этого и других случаев, когда требуется детектировать в пробе не одну, а сразу несколько последовательностей, был разработан метод мультиплексной ПЦР. Чтобы получить копии нескольких последовательностей, праймеры в ПЦР-смесь добавляют с расчетом по 2 штуки на каждый амплифицируемый фрагмент (Рис. 6Б). Помимо выявления патогенов, мультиплексная ПЦР также отлично подходит для одновременного детектирования нескольких мутаций в заданных генах ²¹ и определения пищевого состава продуктов питания. Например, для выявления сильных пищевых аллергенов ²². Благодаря обширному диапазону приложений этот подход завоевал широкое признание среди специалистов.

Когда требуется снизить число неспецифических продуктов реакции, можно воспользоваться методом вложенной ПЦР. В этом случае амплифицируют два фрагмента: один из них — более длинный, а другой, встроенный в него, более короткий — искомый (Рис. 6В). Благодаря тому, что последовательно проводится ПЦР сначала крупного, а затем малого фрагмента, более крупный фрагмент выступает в качестве дополнительной матрицы для малого, тем самым увеличивая специфичность амплификации искомой последовательности. Метод вложенной ПЦР используют в исследованиях, требующих высокой точности результата, или для последовательностей, амплификация которых затруднена ²³^, ²⁴. Хотя метод вложенной ПЦР имеет очевидные преимущества, его использование требует более детального знания целевой нуклеотидной последовательности, что не всегда возможно ²⁵.

Рис. 6. Принцип работы ОТ-ПЦР, мультиплексной ПЦР и вложенной ПЦР.
Источник 1 >> ; Источник 2 >> ; Источник 3 >>

Будущее метода ПЦР

С каждым годом появляются все новые и новые молекулярно-биологические методы, но вот уже более 20 лет ПЦР был и остается одним из ключевых решений, без которого невозможно представить развитие биологических наук и медицины. Работа с генетическим материалом почти всегда ассоциирована с крайне малыми количествами исходного вещества. Поэтому ПЦР, увеличивающая это количество, часто является начальным этапом в решении самых разных биолого-медицинских задач.
Несмотря на постоянное развитие этой технологии, даже последние ПЦР-разработки сталкиваются с некоторыми методологическими проблемами ²⁶. Например, результат ПЦР-диагностики все еще в значительной степени зависит от качества генетического материала в исходном образце. Амплификация обогащенных ГЦ-основаниями последовательностей с помощью ПЦР затруднена: из-за образования прочного химического взаимодействия, если Г и Ц часто встречаются подряд в одной цепи, они могут образовать вторичные структуры, что препятствует дальнейшему синтезу. Наконец, развитие ПЦР-технологий идет в направлении миниатюризации: создание миниатюрных ПЦР-систем станет новой вехой в клинической практике. Быть может, однажды мы сможем купить такой тест даже в аптеке!