Медиатека

В других статьях о работе с биологическими молекулами мы перечислили разные методы доставки нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) в клетки. В данной статье мы разберем их более подробно, обсудим базовые принципы, преимущества и недостатки.

Трансфекция — это процесс внедрения экзогенной (чужеродной) нуклеиновой кислоты (НК) в клетки и один из важнейших инструментов генной инженерии. В зависимости от типа клеток этот процесс называют трансформацией (в бактерии, растения, грибы), трансфекцией (в клетки животных) или трансдукцией (внедрение ДНК в составе вирусов в любые клетки). Способов доставки НК в клетки к настоящему времени известно достаточно много (Таблица 1), и в каждом используются разные принципы, которые необходимо учитывать в зависимости от типа и назначения клеток. Идеальный метод должен иметь высокую эффективность трансфекции, низкую клеточную токсичность, минимальное воздействие на нормальную физиологию, а также быть простым в использовании и воспроизводимым. Кроме того, эффективность доставки НК зависит не только от способа трансфекции, но и от происхождения и типа клеток (бактериальные, растительные, животные, первичные и т.д.), их состояния на момент трансфекции, конфлюэнтности (плотности), типа НК и других факторов.

Таблица 1. Разнообразие методов трансфекции. ¹

Биологические методы

Вирус-опосредованная трансфекция, или трансдукция, основана на природном свойстве вирусов проникать в клетки и внедрять в них свой генетический материал. Если некоторые вирусные гены заменить на целевые гены, необходимые исследователю, то вирус с такой же эффективностью доставит их в клетку. Трансдукция — это высокоэффективный и простой в использовании метод, который прочно вошел в лабораторную и клиническую практику ².

Используемые вирусные векторы можно разделить на два типа: интегрирующие и неинтегрирующие. Первые, такие как ретровирусные, лентивирусные и адено-ассоциированные вирусные векторы, могут интегрироваться в геном клетки-хозяина и обеспечивать стабильную экспрессию чужеродного гена, тогда как неинтегрирующиеся векторы (например, аденовирусный вектор) сохраняются в ядре без интеграции в хромосомную ДНК. Однако при этом экспрессия гена временная (транзиентная трансфекция).

Основные недостатки вирусной трансдукции – иммуногенность и цитотоксичность. Введение вирусного вектора может вызвать воспалительную реакцию и инсерционную мутацию, поскольку он случайным образом интегрируется в геном хозяина. Это может привести к нарушению работы генов-супрессоров опухолей, активации онкогенов или мутагенезу кодирующих генов. Еще один недостаток этого метода – ограниченная ёмкость вирусных векторов. Для сохранения инфекционности вируса в его геном можно вставить последовательность, которая не превышает определённые размеры для конкретного вируса. По этим причинам было предпринято много усилий для разработки методов невирусной трансфекции клеток, о которых речь пойдет ниже. ¹

Еще одним биологическим способом является доставка рекомбинантных ДНК в клетки растений с помощью особых бактерий. Этот метод называется агроинфильтрация и заключается в том, что в межклеточное пространство производится инъекция генетически модифицированных бактерий рода Agrobacterium sp., несущих целевой ген. Агробактерии переносят в растительную клетку нужную последовательность, которая затем встраивается в геном клетки-хозяина. Этот механизм ученые позаимствовали у патогенных агробактерий, которые с помощью особых плазмид (Ti- или Ri-плазмид) внедряют в растительные клетки специальные гены, заставляющие клетки неограниченно делиться и синтезировать необходимые агробактериям вещества. ³

Физические методы

В основе физических методов трансфекции лежит принцип пермеабилизации (изменении проницаемости) клеточной мембраны с помощью различных физических воздействий ^{4, 5, 6}.

Микроинъекции позволяют напрямую доставлять нуклеиновые кислоты внутрь клетки (и даже внутрь отельных органелл, например, ядра) с помощью специальной капиллярной иглы. Этот метод считается высокоточным, но трудоемким, требует специально обученного персонала или роботизированной системы, которая отличается точностью и эффективностью, что позволяет предотвратить повреждение клеток. ⁷

Сходный принцип имеет метод, названный импалефекцией, только вместо одной капиллярной иглы в этом случае используется платформа с расположенными на ней множественными «наноиглами» — углеродными нанотрубками и другими наноматериалами, на поверхности которых прикрепляются НК. Такие нанотрубки протыкают клеточную мембрану и НК высвобождаются внутрь клеток. ^{8, 9}

Электропорация является одним из наиболее широко используемых методов физической трансфекции благодаря своей простоте, быстроте и дешевизне. Специальный прибор — электропоратор — в который помещаются клетки, создает электрическое напряжение для кратковременного повышения проницаемости клеточной мембраны за счет образования поровых отверстий, через которые может проникнуть экзогенная нуклеиновая кислота. Чем больше напряжение, тем крупнее образующиеся поры. Если определить оптимальные условия электропорации, можно быстро и легко трансфицировать большое количество клеток. Этот метод используется для переноса НК в широкий круг целевых клеток, включая бактерии, животных и протопласты растений. Кроме того, электропорацию используют для доставки НК в трудно трансфицируемые клетки, такие как первичные клетки, стволовые клетки и линии В-клеток. Однако этот метод ограничен цитотоксичностью, что объясняется воздействием импульсных электрических полей на биомолекулы, включая изменение электроконформации липидных мембран, белков и ДНК, а также окислительное повреждение из-за генерируемых активных форм кислорода. ^{5, 6}

Сонопорация, или трансфекция с помощью высокоинтенсивного ультразвука, включает использование техники микропузырьков, образующихся при кавитации газа, для создания отверстий в клеточной мембране и облегчения переноса генетических материалов. ¹⁰

Трансфекция с использованием лазера, также известная как фотопорация, оптопорация или фототрансфекция, основана на использовании импульсного лазера для облучения клеточной мембраны с образованием временной поры. Когда лазер индуцирует пору, нуклеиновые кислоты из среды переносятся в клетку из-за осмотической разницы между средой и цитозолем. Лазерный метод позволяет наблюдать за трансфицируемой клеткой и создавать поры в любом месте клетки, но для этого требуется дорогостоящая система лазер-микроскоп. ¹

Электропорация, сонопорация и трансфекция с помощью лазера могут привести к повреждению клеточной мембраны и необратимой гибели клеток. Для сравнения, трансфекция с помощью магнита, или магнитофекция, менее разрушительна для клеток, но в то же время и менее эффективна. Этот метод заключается в присоединении нуклеиновых кислот к магнитным частицам оксида железа и перемещении их в клетки-мишени с помощью магнитов. ^{4, 5}

Еще один интересный подход — биолистическая (биологическая баллистическая) система доставки частиц, которую чаще называют «генной пушкой». Этот метод был впервые представлен для трансформации растительных клеток, но потом его расширили для использования в различных организмах, включая бактерии, дрожжи и клетки млекопитающих, особенно трудно трансфицируемые. Такие «пушки» можно нацелить на отдельные органеллы, например, хлоропласты и митохондрии. Биолистическая доставка работает путем связывания комплексов нуклеиновых кислот с атомами металлов, чаще всего вольфарама или золота, и ускорения таких частиц через вакуум для доставки в целевую клетку или ткань, то есть клетки фактически бомбардируются микрочастицами. Биолистический подход помогает сэкономить время за счет обхода клеточных эндосомальных процессов и делает генный продукт легко доступным внутри клетки. ⁴

Химические методы трансфекции

По сравнению с физическими методами трансфекции химическая трансфекция подразумевает использование специальных химических соединений, помогающих перенести чужеродную нуклеиновую кислоту в клетки. Обычно используются вещества, которые электростатически конденсируют или инкапсулируют нуклеиновые кислоты в наночастицы или агрегатные комплексы, которые затем связываются с клеточными мембранами за счет взаимодействий зарядов или связывания с поверхностными рецепторами. Дальнейшее проникновение внутрь клетки может происходить посредством макропиноцитоза, эндоцитоза, опосредованного клатрином, или эндоцитоза, опосредованного кавеолами, в зависимости от размера и заряда наночастиц. Как правило, размер и заряд наночастиц можно регулировать, изменяя соотношение нуклеиновой кислоты и состава носителя. ¹¹

Одним из самых первых химических методов трансфекции был кальций-фосфатный метод, успешно примененный в 1973 году для переноса молекул ДНК в клетки ¹². Этот метод основан на использовании положительно заряженных ионов кальция для связывания с отрицательно заряженным остовом НК и образования коприцепитатного комплекса, который затем поглощается клетками. Простота и дешевизна являются преимуществами данного метода, однако по эффективности он сильно уступает современным подходам, в которых применяется большое разнообразие химических соединений, включая катионные липиды, полимеры, аминокислоты и другие.

Липофекция, или липосомная трансфекция, — это трансфекция с использованием липидных липосом и на данный момент самый распространенный способ химической трансфекции животных клеток. В основе метода лежит свойство катионных липидов (липиды с положительно заряженными головными группами) образовывать в растворе сферообразные везикулы — липосомы. При смешивании нуклеиновых кислот и липокатионов в растворе липосомы образуются спонтанно. При этом молекулы НК инкапсулируются внутрь липосом с образованием ДНК-липидных комплексов. Основную массу применяемых липокатионов составляют фосфолипиды, сходные с фосфолипидами клеточной мембраны. Для большей эффективности слияния липосом с мембраной и высвобождения НК также добавляют вспомогательные липиды (ко-липиды) и другие молекулы (полисахариды, пептиды, неорганические соединения). Благодаря своему размеру, свойствам, а также биосовместимости липосомы являются многообещающими системами доставки не только НК, но и лекарств ¹³. Липофекция – это эффективный и простой способ доставки НК в клетки, однако он часто ассоциирован с высокой токсичностью для клеток из-за избытка заряженных липидов. Кроме того, ДНК-липосомные комплексы нестабильны в культуральной среде с добавлением сыворотки.

Менее токсичной, но и менее эффективной альтернативой липосомам служат нелипосомные катионные липиды (DOTMA, DOTAP, DCChol, DOGS) и катионные полимеры (ДЕАЕ-декстран, полиэтиленэмин (PEI), полилизин) которые также образуют комплексы с НК (липоплексы и полиплексы, соответственно) ⁶. Еще один класс необычных полимеров — дендримеров — способен образовывать комплексы с нуклеиновыми кислотами — дендриплексы — для транспортировки в клетки. Дендримеры — это высокомолекулярные соединения со сложной разветвленной архитектурой, часто принимающие сферическую трехмерную форму. Процесс комплексообразования между дендримерами и НК принципиально не отличается от других катионных полимеров с высокой плотностью заряда, основан на электростатических взаимодействиях и не имеет какой-либо специфичности к последовательности. Свойства этих наноматериалов делают их очень перспективными для разработки синтетических систем доставки терапевтических нуклеиновых кислот. ¹⁴

Для трансформации прокариотических клеток рекомбинантной плазмидной ДНК существует несложный способ, в котором сочетаются методы химической и физической трансфекции. Прокариотические клетки, которые способны захватить экзогенную ДНК, называют компетентными. «Помочь» клеткам стать компетентными можно с помощью химических соединений, например, хлорида кальция или хлорида рубидия. Полученные химически компетентные клетки далее подвергают «тепловому шоку» — быстрому кратковременному нагреву от 0°C до 40-50°C и быстрому охлаждению. Во время культивирования клеток с химическими веществами происходит пермеабилизация мембраны и образование отверстий, а «тепловой шок» катализирует захват клеткой экзогенной ДНК из раствора.

Классические методы, рассмотренные в этом обзоре, успешно применяются на практике уже несколько десятилетий. Интерес к трансфекции, несомненно, растет, особенно в терапевтических целях в условиях растущей востребованности генной терапии. Поэтому можно с уверенностью ожидать появления новых и усовершенствования уже имеющихся методов трансфекции.

Литература

1. Kim T.K., Eberwine J.H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2010.

2. Bulcha J.T. et al. Viral vector platforms within the gene therapy landscape. Signal Transduction and Targeted Therapy, 2021.

3. Чуб В.В. Растения-ГМО: как это делается. Потенциал: Химия. Биология. Медицина, 2011.

4. Das A., Gupta P., Chakraborty D. Physical methods of gene transfer: Kinetics of gene delivery into cells: A Review. Agricultural Reviews, 2015.

5. Kaustubh A.J., Mohan N.R., Ambikanandan M. 3 - Gene Delivery Using Physical Methods. Challenges in Delivery of Therapeutic Genomics and Proteomics, 2011.

6. Chong Z.X., Yeap S.K., Ho W.Y. Transfection types, methods and strategies: a technical review. PeerJ, 2021.

7. Chow Y.T. et al. Single Cell Transfection through Precise Microinjection with Quantitatively Controlled Injection Volumes. Scientific Reports, 2016.

8. McKnight T.E. et al. Tracking Gene Expression after DNA Delivery Using Spatially Indexed Nanofiber Arrays. Nano Letters, 2004.

9. Riley M.K, Vermerris W. Recent Advances in Nanomaterials for Gene Delivery-A Review. Nanomaterials (Basel), 2017.

10. Tomizawa M. et al. Sonoporation: Gene transfer using ultrasound. World Journal of Methodology, 2013.

11. Hamann A., Nguyen A., Pannier A.K. Nucleic acid delivery to mesenchymal stem cells: a review of nonviral methods and applications. Journal of Biological Engineering, 2019.

12. Graham F.L., van der Eb A.J. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology, 1973.

13. Akbarzadeh A. et al. Liposome: classification, preparation, and applications. Nanoscale Research Letters, 2013.

14. Dufès C., Uchegbu I.F., Schätzlein A.G. Dendrimers in gene delivery. Advanced Drug Delivery Reviews, 2005.