Медиатека

В природе существует много примеров мимикрии: палочники, напоминающие сухие ветки, орхидейные богомолы, сливающиеся с цветками, а иногда копия становится почти неотличимой от оригинала. Бабочки-листовидки (род Kallima) из Юго-Восточной Азии имеют яркую окраску, типичную для их семейства, но со сложенными крыльями их невозможно отличить от сухих листьев (Рис. 1). Крылья имитируют их не только цветом — узор повторяет и жилкование, и фактуру, и даже следы разложения, а оканчиваются они отростком, напоминающим черешок. Эволюционное развитие такого сложного признака — большая загадка для исследователей: формировался ли он постепенно или скачкообразно, каковы генетические механизмы? В статье 2022 года The evolution and diversification of oakleaf butterflies, вышедшей в журнале Cell, авторы вплотную приблизились к пониманию этих вопросов ¹.

Рис. 1. Бабочка Kallima inachus. Источник >>

Эволюция рода Kallima

Чтобы изучить эволюционную историю рода Kallima, исследователи собрали 36 образцов, относящихся к 6 видам (K. knyvettii, K. limborgii amplirufa, K. paralekta, K. incognita и K. alicia), из 11 мест обитания бабочек в Восточной и Юго-Восточной Азии (Рис. 2). 3 вида обитали в Юго-Западном Тибете — это навело исследователей на мысль, что Гималаи были либо центром происхождения рода, либо рефугиумом — местом, где вид переживал неблагоприятные климатические условия. Чтобы это подтвердить, было изучено 105 полногеномных сиквенсов из 21 рода бабочек, относящихся к семейству нимфалид, в том числе из рода Kallima, и сконструировано филогенетическое дерево. Kallima, как и ожидалось, образуют на нём монофилетическую группу, но в целом группа мимикрирующих под листья бабочек — полифилетическая. Иными словами, этот тип мимикрии появлялся неоднократно.

Чтобы проследить появление рода Kallima, исследователи использовали метод главных компонент (PCA) и программу ADMIXTURE, применяемую для определения вклада предковых популяций в формировании конкретного генотипа, как, например, разных этнических групп в одном человеке. Их подход был направлен на выявление популяционной структуры предкового вида на основании данных о генотипах. Построение моделей в ADMIXTURE с последующей кросс-валидацией показало, что он, вероятнее всего, состоял из 5 популяций, что примерно соответствует 6 исследуемым видам.

Далее исследователи использовали методы Sequential Markovian Coalescent (PSMC и SMC++) для моделирования размера популяций бабочек и процесса дивергенции видов (принцип их работы состоит в принятии гипотезы о корреляции между генетическим разнообразием популяций и их размером). Как оказалось, для материковых видов характерен больший размер предковой популяции, чем для островных. Например, для островного вида K. knyvettii. С целью дальнейшего изучения популяционной динамики выбранных видов был проведён анализ с использованием Generalized Phylogenetic Coalescent Sample (G-PhoCS) и Tree-mix. Оба метода подтвердили наличие потока генов внутри предкового вида — из материковых популяций бабочек в островные. Например, из популяций Медога (Юго-Восточный Тибет) в островные популяции на Хайнане (где на данный момент обитает K. alicia alicia) и Яве (K. paralekta).

Рис. 2. Места сбора бабочек рода Kallima c фотографиями верхней и нижней стороны крыльев.

С учётом данных о потоке генов и времени расхождения видов исследователи сделали вывод о роли климата в видообразовании. Изначально все бабочки рода Kallima, обитающие в регионе Сундаланд, представляли одну популяцию, так как до подъёма уровня воды в среднем плейстоцене эта территория была частью материка. В это же время возникли K. incognita и K. inachus chinensis. Затем подъём уровня океана спровоцировал разделение популяции за счёт изоляции особей на появившихся островах — Борнео, Суматре и Яве. Аналогично, остров Тайвань был когда-то соединён с материком. Поэтому, вероятно, многие виды бабочек возникли в результате этих событий, но, так как они происходили постепенно, поток генов сохранялся ещё некоторое время. Принимая во внимание ледниковые периоды, исследователи оценили возможный ареал обитания бабочек в разное время с помощью модели, полученной с применением машинного обучения на основании 19 стандартных биоклиматических показателей в программе Maxent. Она определяет, какой параметр наиболее важен для вида и делает предсказание на его основе. Результат построения подтверждает гипотезу о том, что Гималаи были подходящими местом обитания бабочек в течении межледниковья. Кроме того, в течении последнего ледникового периода острова должны были вновь стать частью материка и обеспечить вторичный контакт между выделившимися видами и подвидами.

Генетические основы окраски

Изучение полиморфизма вентральной окраски проводилось на подвиде K. i. chinensis. Чтобы охарактеризовать и систематизировать фенотипы, учёные провели ряд скрещиваний бабочек с разными формами узора. В итоге крылья бабочек разделились на 10 чётко различимых форм (Рис. 3), которые образуются при взаимодействии 5 аллелей: P — простой, V — с жилкой, S — смешанный, R — рябой, M — покрытый плесенью.

Рис. 3. Разнообразие фенотипов K. inachus chinensis.

Чтобы найти локус листовой мимикрии были секвенированы геномы 78 бабочек и сделан полногеномный поиск ассоциаций (GWAS) для сравнения разных форм. Разница в фенотипе чётко коррелировала с одним локусом на 26 хромосоме. При этом исследователи заметили, что перед этим локусом располагается ген cortex, который известен тем, что контролирует окраску крыльев и тела у шелкопрядов, участвует в проявлении Бейтсовской мимикрии у бабочек рода Heliconius (съедобный вид имитирует ядовитый), обеспечивает индустриальный меланизм у берёзовых пядениц и сезонность окраски у бабочек Junonia coenia. Таким образом, ген cortex важен для морфогенеза крыльев, и эволюционное изменение этого гена, как правило, коррелирует с изменением окраски.

В действительности аллели P, V, S, R и M представляют собой несколько наследуемых вместе аллелей в одном локусе, то есть гаплотип. Так как гаплотип идёт после гена cortex, его обозначили тем же именем. Исследователи решили узнать механизм сцепленного наследования, ограничивающий рекомбинацию в гаплотипе cortex, и провели de novo сборку геномов K. i. chinensis с разными фенотипами. Определение гаплотипа бабочек проводилось секвенированием ДНК из ткани лапки методом Сенгера. Для этого исследователи выбрали HiPure Insect DNA Kit.

Оказалось, гаплотипы V и R имеют инверсии в этих участках, что в норме репрессирует кроссинговер — один из видов рекомбинации. Кроме того, инверсии затрагивают ген cortex: в случае с V они разделяют ген с его дистальным промотором и несколькими фланкирующими генами, которые, согласно данным из других статей, также вовлечены в формирование окраски бабочек ². Филогенетический анализ гаплотипов показал, что V и M, а также R и S кластеризуются вместе, что указывает на рекомбинацию между ними. Таким образом, инверсии — неубедительная причина формирования гаплотипа.

Анализ частоты синонимичных и несинонимичных замен в гене cortex показал позитивную селекцию вторых, поэтому исследователи продолжили поиск в другом направлении. Они проанализировали укладку хроматина (Hi-C) в области гаплотипа, но не выявили топологически ассоциированного домена. В итоге авторы статьи пришли к выводу, что в репрессию вовлечены ретротранспозоны, так как оказалось, что их количество растёт по краям редко рекомбинирующих областей, и учёные усматривают в этом корреляцию. Хотя механизм такой репрессии не ясен.

Для подтверждения ключевой роли гена cortex в формировании окраски исследователи использовали систему CRISPR-Cas9 (более подробно о системе редактирования генома CRISPR/Cas вы можете прочитать в нашей статье). Полученные мозаичные мутанты были нокаутами по гену cortex. Потеря функции этого гена в отдельных участках тела выражалась в нарушении пигментации — узор становился размытым и более тёмным. Генотипирование мозаичных мутантов с помощью ПЦР требовало выделение ДНК из отдельных крыльев, что стало возможным благодаря набору TransDirect Animal Tissue PCR Kit.

Для понимания развития рисунка на крыльях в онтогенезе исследователи изучили экспрессию гена cortex с помощью ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией и секвенировали РНК бабочек с генотипами VP и PP на разных стадиях развития: предкуколки, 1 и 2 дня после окукливания, а также гусеницы 5-го возраста, так как именно во время этой стадии начинается активная экспрессия генов, связанных с формированием узора на крыльях.

У окуклившихся бабочек VP уровень экспрессии cortex выше, чем у PP, и остаётся таким в течении нескольких дней. Кроме того, in situ гибридизация (ISH) с зондами к cortex на стадии гусеницы 5-го возраста показала, что cortex экспрессируется вдоль будущего края крыльев.

Сравнение паттерна экспрессии у бабочек с генотипами VP и PP на разных стадиях развития выявило ген snake, который повышает экспрессию у VP после окукливания. Ген shake — известный регулятор развития окраски у семейства парусников (Papilionidae). Учитывая наличие корреляции с экспрессией cortex, исследователи считают его следующим участником процесса развития крыла.

Эволюция полиморфизма окраски

Полиморфизм окраски крыльев появился ещё до разделения рода Kallima и идентичен у изученных видов. Судя по собранным данным, эволюционно гаплотипы M и S первыми дивергировали из предковой формы — гаплотипа P, затем инверсии в них привели к появлению гаплотипов V и R соответственно. Существование одновременно и предковых, и дочерних форм говорит о том, что на протяжении всего существования рода не происходило исчезновения одного варианта в пользу закрепления другого.

Сравнение различных популяционных моделей и фактической частоты аллелей показало наибольшую схожесть с отрицательным частотно-зависимым отбором. Иначе это можно назвать балансирующим отбором, то есть отбором, благоприятствующим разнообразию форм. Исследователи считают, что биологическая роль этого эффекта заключается в возможности каждого гаплотипа улучшать мимикрию независимым от остальных способом, повышая приспособленность гетерозигот. В пользу данной гипотезы свидетельствует то, что гаплотипы R и M не встречаются в гомозиготном состоянии. Помимо наличия нескольких форм, вероятно, есть ещё один механизм, повышающий разнообразие окрасок — размер интронов cortex варьируется сильнее, чем у близлежащих генов, что, возможно, говорит о наличии альтернативного сплайсинга.

Исследователи считают, что одним из главных результатов их работы стало открытие ещё одного примера отрицательного частотно-зависимого отбора, которых на сегодняшний день немного, и они требуют длительного изучения. Кроме того, работа может считаться примером скрупулёзно выполненного макро- и микроэволюционного анализа и представлять интерес в методическом плане. Исследователи применили наиболее современные научные подходы, комбинируя их друг с другом, и тщательно подошли к пробоподготовке.

Литература

1. Wang S. et al. The evolution and diversification of oakleaf butterflies. Cell, 2022.

2. van der Burg K.R.L. et al. Genomic architecture of a genetically assimilated seasonal color pattern. Science, 2020