Медиатека

18.02.2022

QIAseq – от образца к открытию

Секвенирование нового поколения (Next Generation Sequencing, NGS) – это группа методов, которые позволяют быстро и точно установить нуклеотидную последовательность нуклеиновых кислот. Данный метод имеет широкое применение, позволяя изучать геномы самых разных организмов. Это приводит к значительным достижениям и новым открытиям в различных исследовательских областях.

Чтобы усовершенствовать исследования на основе NGS и помочь ученым в достижении своих целей, QIAGEN разработал линейку продуктов QIAseq. Линейка QIAseq предлагает специализированные решения¹ возможных проблем на любом этапе секвенирования – от подготовки образцов до анализа:

Таргетные панели QIAseq представляют собой экономически эффективный способ таргетного обогащения, не усложняя при этом процессы анализа и интерпретации данных.
Продукты для подготовки библиотеки QIAseq позволяют провести секвенирование всего генома или транскриптома и избежать ошибок, связанных с ПЦР-дубликатами.
QIAseq предлагает оптимизированный рабочий процесс без ПЦР для изучения полных геномов или транскриптомов одиночных клеток.
QIAGEN Bioinformatics сочетает в себе лучшее в своем классе программное обеспечение для анализа и интерпретации данных NGS с доступом к уникальной базе знаний, курируемой экспертами.

Уникальные молекулярные индексы UMI

Уникальные молекулярные идентификаторы/индексы (Unique Molecular Indices, UMI) – это молекулярные маркеры, обеспечивающие коррекцию ошибок секвенирования и повышенную точность получаемых данных. Они представляют собой² короткие олигонуклеотидные последовательности, используемые для уникальной маркировки каждого фрагмента ДНК в NGS-библиотеке до амплификации.

Многие коммерчески доступные методы подготовки библиотек используют полимеразную цепную реакцию, которая зачастую является источником возможных ошибок, связанных, например, с ПЦР-дубликатами. Это значительно ограничивает вероятность обнаружения истинных редких вариантов. Таргетные панели QIAseq преодолевают эти проблемы за счет использования UMI.

UMI играют роль уникальных маркеров³ фрагментов ДНК библиотеки. Таким образом, даже при неравномерной амплификации можно получить равномерное покрытие всего генома путем подсчета количества UMI, а не общего количества чтений. Чтения, имеющие разные UMI, представляют собой разные исходные молекулы, в то время как чтения последовательностей, имеющие одинаковые UMI, являются копиями⁴ одной исходной молекулы.

Рис.1. Принцип устранения ошибок и отклонений при подсчете чтений с помощью молекулярных индексов UMI.

Также можно отличить вариантные аллели, присутствующие в исходном образце, от ложноположительных результатов, возникших вследствие ошибок, допущенных во время подготовки библиотеки и секвенирования.

Рис.2. Принцип³ обнаружения истинных вариантных аллелей с помощью уникальных молекулярных индексов UMI.

Уникальные двойные индексы UDI

При использовании уникальных двойных индексов (UDI) все молекулы ДНК в образце помечаются двумя уникальными индексами, что обеспечивает более надежное обнаружение редких вариантов и более точное демультиплексирование при параллельном секвенировании нескольких библиотек в одном цикле.

Уникальные двойные индексы позволяют увеличить⁵ количество образцов, секвенируемых за цикл, до 96, и в связи с этим снизить затраты на образец по сравнению с другими стратегиями индексирования.

Рис 3. Сравнение⁵ уникальных и комбинаторных двойных индексов.

Помимо уникальных двойных индексов возможно использование комбинаторных двойных индексов. При подготовке библиотек рекомендуется использовать уникальные двойные индексы, так как они помогают выполнять демультиплексирование с повышенной точностью.

Рис 4. Уменьшение ошибок⁶ вследствие контаминации с помощью уникальной двойной индексации.

К преимуществам уникального двойного индексирования относятся:

Более высокая эффективность мультиплексирования и демультиплексирования.
Снижение затрат на образец за счет включения большего количества индексов в цикл секвенирования по сравнению с двойными комбинаторными или одиночными индексами.
Снижение ошибок, связанных с неверным присвоением индекса при подготовке образцов, секвенировании и анализе.

Удлинение праймера с одного конца (Single primer extension)

Чтобы преодолеть проблемы и возможные ошибки, связанные с ПЦР-амплификацией в процессе NGS, помимо уникальных молекулярных индексов UMI используется технология⁷ single primer extension (SPE), которая обеспечивает гибкость в дизайне и высокоспецифичную селекцию нужных геномных участков.

После удаления неиспользованных адаптеров проводится определенное количество циклов ПЦР с использованием адаптерного праймера Illumina и пула одиночных праймеров, каждый из которых несет ген-специфичную последовательность и универсальную 5'-последовательность. При этом нарабатывается один и тот же целевой локус из разных ДНК-матриц. После этого проводятся дополнительные циклы ПЦР с использованием универсальных праймеров для присоединения адаптеров Illumina и последующей амплификации библиотеки.

Рис 5. Принцип метода SPE.

По сравнению с существующими подходами таргетного обогащения, метод SPE основан на лигировании адаптера к одному концу фрагмента двухцепочечной ДНК, что имеет гораздо более высокую эффективность, чем лигирование адаптеров к обоим концам фрагмента двухцепочечной ДНК. Как следствие, больше молекул ДНК доступно для дальнейшего этапа обогащения в ходе ПЦР.

Заключение

В настоящее время идет бурное развитие методов исследования молекулярных структур живых организмов. Появление методов секвенирования нового поколения позволяет геномике развиваться быстрее и использовать сложные технологии и многоэтапные протоколы, что приводит к ошибкам и недостоверным результатам в процессе проведения исследований.