Медиатека

Моноклональные антитела, специфичные к одному антигену, широко применяются в современной медицине для лечения аутоиммунных, воспалительных и онкологических заболеваний ¹. Из пяти классов антител, различающихся аминокислотными последовательностями тяжелых цепей, в терапевтических целях чаще всего используются антитела класса IgG, на которые приходится до 75% от всех иммуноглобулинов ².

Основная трудность при выделении моноклональных антител из иммунизированных животных или плазмы выздоровевшего человека (конвалесцентной плазмы) заключается в отборе антигенспецифичных клеток, доля которых не превышает 0.1% от общего количества B-клеток ³. Помимо этого, даже при создании комбинаторных фаговых библиотек – популяций бактериофагов, экспонирующих на своей поверхности уникальные антигенсвязывающие домены антител – белковые цепи иммуноглобулинов антигенспецифичных клеток могут комбинироваться с таковыми у неспецифичных клеток, что также снижает долю «целевых» антител.

Ученые из США предложили усовершенствованный метод выделения антигенспецифичных IgG+ В-клеток памяти из селезенки и лимфатических узлов иммунизированных мышей, позволяющий повысить селективность отбора до 51–88% по сравнению с 5% у традиционных методов ⁴. Методика создания комбинированных клонов из антигенспецифичных и неспецифичных IgG+ B-клеток позволяет повысить частоту функциональных клонов и разнообразие активных центров антигенсвязывающего фрагмента иммуноглобулина.

Рис.1. Этапы высокоселективного выделения IgG-положительных В-клеток памяти из культуры клеток лимфатических узлов и селезенки иммунизированных мышей. ⁴

Трансгенные мыши, экспрессирующие гены легких цепей иммуноглобулина человека, были иммунизированы 4-5 раз с интервалом в 2 недели 5-ю типами антигенов, включающих мембранные и циркулирующие белки. После удаления IgM/IgD-положительных клеток, меченых специфичными биотинилированными антителами, учёные провели иммуномагнитную сортировку IgG+ В-клеток.

Вся процедура занимала около 1 часа и включала четыре основных этапа:

• лизис эритроцитов;
• удаление Т-лимфоцитов;
• удаление IgM/IgD+ В-клеток;
• выделение антигенспецифичных В-клеток посредством иммуномагнитной сортировки.

Поскольку большинство рекомбинантных антигенов содержат аффинные метки, ученые использовали избыток нецелевых антигенов с аналогичными метками для исключения специфичных к меткам В-клеток. Проведение отбора клеток в растворе вместо иммобилизации антигенов на пластиковых поверхностях позволило избежать стерического несоответствия и предотвратить денатурацию и нарушение функциональной конформации белков.

Основным ограничением метода является его селективность к B-клеткам памяти, экспрессирующим мембранные IgG, в то время как более зрелые плазматические клетки, не содержащие поверхностные IgG, данным методом выделить не получится.

Представленная технология позволяет значительно сократить время получения целевых клеток и стоимость процедуры за счет удаления нежелательных клонов и увеличения вероятности отбора целевых функциональных клонов.

Литература

1. Quinteros D.A. et al. Therapeutic use of monoclonal antibodies: general aspects and challenges for drug delivery. Nanostructures for Drug Delivery, 2017.

2. Bilal M., Ghatol A. Understanding How Monoclonal Antibodies Work. Treasure Island: StatPearls Publishing, 2022.

3. Franz B. et al. Ex vivo characterization and isolation of rare memory B cells with antigen tetramers. Blood, 2011.

4. Mahendra A. et al. Honing-in antigen-specific cells during antibody discovery: a user-friendly process to mine a deeper repertoire. Nature Communications Biology, 2022.