Медиатека

Неонатальный скрининг методом ВЭЖХ-МС

Что такое неонатальный скрининг?

Наследственные болезни обмена веществ – это многочисленная и разнородная группа моногенных нарушений, приводящих к недостаточной активности или полному отсутствию определенных ферментов в цепочках промежуточного метаболизма из-за сбоев в генетическом коде человека. Каждое нарушение в отдельности встречается редко, однако кумулятивная заболеваемость относительно высока и составляет 1 на 1500–5000 живорождений в зависимости от региона. В связи с выраженными клиническими проявлениями, врожденные дефекты метаболизма – серьёзная причина заболеваемости, особенно у детей. Однако многие такие болезни успешно корректируется диетой и лекарственными препаратами при условии начала терапевтических мероприятий сразу после рождения. Последствия несвоевременной диагностики и лечения включают среднетяжелые нервно-психические расстройства, умственную отсталость и даже летальный исход.

Неонатальный скрининг, который считают одним из главных достижений педиатрии XX века, позволяет обнаружить наследственные нарушения метаболического происхождения у внешне здоровых младенцев за счёт измерения содержание метаболитов в биологических жидкостях и выявления специфических для тех или иных болезней отклонений от нормальных значений. Первым примером послужила работа Роберта Гатри 1, предложившего в 1963 г. способ ранней диагностики такого серьезного психического заболевания, как синдром Феллинга, или фенилкетонурия. Заболевание выявили с помощью реакции микробного торможения по повышенному содержанию фенилаланина в крови или моче новорожденных, который возникает из-за ошибки в гене, кодирующем фермент фенилаланин-гидроксилаза. Синдром Феллинга можно полностью излечить назначением специальной диеты.

Метаболиты – промежуточные продукты катализируемых ферментами реакций обмена веществ в живых клетках. Обычно термин используется для обозначения низкомолекулярных соединений.


С целью сбалансированного подхода к неонатальному скринингу ВОЗ разработала рекомендации, известные как критерии Вильсона-Юнгера (Wilson-Jungner), для включения метаболических биомаркеров генетических нарушений в программу лабораторных исследований:

1. Вызываемая патология должна представлять серьезную угрозу здоровью и качеству жизни.
2. Причины заболевания должны быть достоверно установлены.
3. Должна существовать ранняя диагностика в виде надежного и доступного лабораторного теста с установленной периодичностью.
4. Должен быть разработан протокол лечения, а для проведения лечения иметься в достаточном количестве подходящие учреждения.
5. Затраты на диагностику не должны сводить на нет экономические преимущества раннего обнаружения болезни.

Грамотно организованный неонатальный скрининг – это не просто набор лабораторных анализов, обнаруживающих отклонение уровня метаболитов от нормы, а комплекс мероприятий, включающий проверку и подтверждение положительных результатов, расследование причин ошибок, выработку тактики лечения и постоянно действующую систему обратной связи между лабораториями, лечащими врачами и органами здравоохранения для оценки эффективности скрининга.

Аналитические методы определения метаболитов в биологических жидкостях

До 1980 г. неонатальный скрининг преимущественно основывался на определении продуктов метаболизма органических кислот в экстракте мочи методами газовой хроматографии (ГХ) с неспецифическим детектированием, когда идентификация метаболитов происходит только по времени удерживания. Появление в конце 1970-х газовых хроматографов с масс-спектрометрическим детектором (ГХ-МС), позволяющих получать масс-спектр пробы для выбранного времени удерживания, кардинально улучшило качество анализа и заложило основу современной клинической диагностики органических ацидемий и дефектов окисления жирных кислот. Начиная с середины 1980-х использование методов ферментного анализа, ГХ-МС и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) способствовало пониманию тесной взаимосвязи нарушений метаболизма жирных кислот с содержанием в моче L-карнитина и ацилкарнитинов. Результатом работы в этом направлении в начале 1990-х стало появление ВЭЖХ-МС/МС – высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием.

Хроматография – лабораторный метод разделения смеси веществ по скорости движения в потоке жидкости или газа при контакте с неподвижной фазой, которую обычно представляет твердое вещество с развитой поверхностью. Чем сильнее вещество взаимодействует с неподвижной фазой, тем медленнее оно движется. ВЭЖХ – жидкостная хроматография под высоким давлением (до 600 атм).


Тандемная масс-спектрометрия

1. Пробоподготовка (кровь)

Из сухих пятен крови на фильтровальной бумаге отбираются пробы диаметром 3–5 мм, содержащие 3–8 мкл крови, и помещаются в метанол с добавлением внутренних стандартов – метаболитов с известной концентрацией. Смеси стандартов поставляются в готовом виде производителями оборудования. В большинстве случаев время экстракции не превышает 30 мин. Согласно литературным данным, полнота экстракции составляет около 90%. После этого экстракт концентрируется высушиванием в токе азота или центрифугируется под слабым вакуумом. В случае ацилкарнитинов и аминокислот пробоподготовка также обычно включает дериватизацию – перевод молекул метаболитов в летучие сложные эфиры обработкой подкисленным безводным бутанолом при 65°C в течение 15 мин. Дериватизированные пробы переносятся в подходящий для конкретной методики растворитель (глицерин/метанол, вода/ацетонитрил и др.)

2. Принцип работы

Тандемная масс-спектрометрия представляет собой сверхчувствительный и экспрессный метод идентификации и определения содержания широкого списка метаболитов. Данный метод основан на ионизации и фрагментации молекул с последующим измерением интенсивности аналитического сигнала ионов с выбранным отношением массы к заряду (m/z). В состав МС/МС спектрометра входят пять основных компонентов: источник ионов, первый масс-анализатор, ячейка столкновения, второй масс-анализатор и детектор. После ввода в прибор на образец воздействует направленный пучок частиц (электронов, ионов или атомов), сильное электрическое поле или лазерное/ультрафиолетовое излучение, приводящие к образованию заряженных частиц, разделяющихся в первом масс-анализаторе по значениям m/z. После этого так называемые «ионы-предшественники» вводятся в ячейку столкновений и при столкновении с атомами инертного газа распадаются на ионы-фрагменты. Образующиеся фрагменты переносятся во второй масс-анализатор, где вновь разделяются по значениям удельной массы и попадают на детектор, регистрирующий количество заряженных осколков молекул с определенным значением m/z. Поскольку в обоих масс-анализаторах, а также ячейке столкновений поток ионов проходит через четыре параллельно и симметрично расположенных монополя (квадруполь), тандемные масс-спектрометры еще называются тройными квадрупольными.

3. Примеры применения

Современный МС/МС скрининг основывается на двух основных классах метаболитов: аминокислоты и ацилкарнитины для диагностирования аминоацидопатий, органических ацидурий и дефектов окисления жирных кислот. Обнаруживаемые нарушения обмена веществ можно разбить на четыре группы: связанные с аминокислотами, органическими кислотами, циклом синтеза мочевины (ЦСМ) и циклом β-окисления. В настоящее время метод позволяет распознавать биомаркеры порядка 40 расстройств метаболизма различной степени тяжести.

Нас Рис. 1 приведены спектры производных фенилаланина в крови пациентов в контрольной группе и с фенилкетонурией (ФКУ), полученные с помощью тройного квадрупольного масс-спектрометра с ионизацией электрораспылением. Стоит отметить значительный рост пика бутаноата фенилаланина с m/z = 222 (Phe) у пациентов с ФКУ по сравнению с здоровыми участниками контрольной группы. При этом высота пика с m/z = 238, соответствующему бутаноату тирозина, не меняется. Это помогает отличить классическую фенилкетоурию от послеродовых осложнений на печень или последствий недоношенности у младенцев, для которых обычно характерно повышенное содержание обеих аминокислот.


Рис. 1. Масс-спектры сухих пятен крови пациентов с фенилкетонурией (A. PKU-Patient) и в контрольной группе (B. Normal) 2

Метилмалоновая ацидемия – это гетерогенное метаболическое расстройство, характеризующееся накоплением в организме одноименной органической кислоты. Данное заболевание с аутосомно-рецессивным типом наследования возникает из-за дефекта пропионатного пути окисления жирных кислот и является одной из самых распространенных органических ацидорурий в мире. Как видно из спектров на Рис. 2, полученных на тандемном масс-спектрометре, у пациентов с метилмалоновой ацидемией повышено содержание пропионилкарнитина и отношение пропионилкарнитина к ацетилкарнитину. В данном случае бутирату пропионилкарнитина соответствует пик с m/z = 274, а бутирату ацетилкарнитина – m/z = 270. В спектре также присутствуют пики внутренних стандартов – немодицифированных пропионилкарнитина и ацетилкарнитина с m/z = 277 и 263, соответственно.


Рис. 2. Масс-спектры сухих пятен крови пациентов с метилмалоновой ацидемией (MMA) и в контрольной группе (Normal) 3

Цикл синтеза мочевины (ЦСМ) выводит из организма излишки азотсодержащих веществ, образующихся в результате разложения протеинов. Дефекты ЦСМ выражаются в повышенном содержании ионов аммония в плазме крови, приводящем к сдвигу кислотно-щелочного баланса. Наиболее распространенным нарушением ЦСМ является недостаточность орнитинтранскарбамилазы, встречающаяся в среднем у одного из 40 000 пациентов. Ранняя диагностика и лечение позволяют снизить содержание аммония и увеличивают продолжительность жизни пациентов.

Анализ методом ионообменной хроматографии с постколоночной дериватизацией, использовавшийся в прошлом для определения содержания аминокислот ЦСМ, отличался большой трудоемкостью и низкой чувствительностью, что делало раннюю диагностику практически невозможной. В последние годы был предложен метод ВЭЖХ-МС/МС с увеличенным до 7 часов временем экстракции, позволяющий измерять концентрацию аминокислот ЦСМ в сухих каплях крови без дериватизации. На Рис. 3 проиллюстрированы различия в уровне аргинина, цитруллина, аргинин-янтарной кислоты, а также суммы глутамина и глутамата у пациентов с различными типами нарушений ЦСМ по сравнению со здоровыми участниками контрольной группы.


Рис. 3. Содержание аминокислот в сухих пятнах крови пациентов с нарушениями ЦСМ: A – аргинин, B – цитруллин, C – аргинин-янтарная кислота, D – сумма глутамина и глутамата. Типы недостаточности: OTCD – орнитинтранскарбамилазы, ASSD – аргининосукцинатсинтазы, ASLD – аргининосукцинатлиазы, NAGSD – N-ацетилглутаминсинтаза, Controls – контрольная группа 4

Для недостаточности аргининосукцинатсинтазы характерно значительное повышение содержания аргинина и цитруллина. Недостаточность аргининосукцинатлиазы можно диагностировать по одновременному росту уровня указанных аминокислот, а также аргинин-янтарной кислоты. При этом говорить с некоторой долей уверенности о недостаточности орнитинтранскарбамилазы можно лишь по умеренному увеличению суммы глутамина и глутамата относительно контрольных образцов.

Обеспечивая транспорт жирных кислот через внутреннюю мембрану в матрикс митохондрий, карнитин выполняет ключевую функцию в цикле β-окисления. При таких патология, как нарушения цикла β-окисления или органические ацидурии, Acyl-CoA-дегидрогеназы накапливаются в матриксе, откуда транспортируются тем же карнитином. При этом для надежной диагностики типа недостаточности важно знать содержание не только самого карнитина, но и изомерных ацилкарнитинов по отдельности. С этой задачей также справляется метод ВЭЖХ-МС/МС с ионизацией электрораспылением и градиентным элюированием. Метод заключается в запрограммированном изменении полярности растворителя на стадии ВЭЖХ и позволяет раздельно определять концентрацию карнитина и 16 изомерных ацилкарнитинов в сыворотке человека и моче с пределом обнаружения 0,05–0,1 мкмоль/л, как показано на Рис. 4.


Рис. 4. A. Хроматограмма общего ионного тока смеси карнитина и 16 ацилкарнитинов. B. Пик сукцинилкарнитина и два пика метилмалонилкарнитина в масс-спектре, соответствующие ионному переходу между исходным ионом и фрагментом m/z 262→83. C. Пик глутарилкарнитина в масс-спектре, m/z 276→83 5

4. Преимущества метода

Тандемная масс-спектрометрия незаменима при анализе сложных смесей. Она предоставляет учёным возможность фокусироваться на исходных ионах с выбранным отношением массы к заряду в первом квадруполе и регулировать условия фрагментации во втором для получения уникального масс-спектра вещества в третьем квадруполе. Таким образом, возможно одновременное определение следовых количеств нескольких десятков метаболитов в одном образце за анализ, длящийся несколько минут. В некоторых случаях разделение может происходить в самом МС/МС спектрометре, минуя стадию ВЭЖХ, что упрощает конфигурацию оборудования. Современные тройные квадрупольные масс-спектрометры обладают широкими возможностями для автоматизации эксперимента и позволяют существенно сократить расходы на проведение измерений в расчете на одну пробу.

Выводы

Появление тандемной масс-спектрометрии в сочетании с ВЭЖХ 30 лет назад произвело революцию в области неонатального скрининга, сравнимую по масштабу с началом применения моноквадрупольных масс-селективных детекторов в газовой хроматографии в начале 1970-х. Непрекращающееся развитие метода МС/МС в вопросе увеличения количества детектируемых метаболитов и снижения предела их обнаружения помогает медицинским специалистам в подтверждении диагнозов и выборе подходов к лечению.


Литература

1. Guthrie R., Susi A. A Simple Phenylalanine Method for Detecting Phenylketonuria in Large Populations of Newborn Infants. Pediatrics, 1963.

2. Lukacs Z., Santer R. Evaluation of electrospray-tandem mass spectrometry for the detection of phenylketonuria and other rare disorders. Molecular Nutrition Food Research, 2006.

3. Pourfarzam M., Zadhoush F. Newborn Screening for inherited metabolic disorders; news and views. Journal of Research in Medical Sciences, 2013.

4. Baruteau J. et al. Urea Cycle Related Amino Acids Measured in Dried Bloodspots Enable Long-Term In Vivo Monitoring and Therapeutic Adjustment. Metabolites, 2019.

5. Maeda Y. et al. Simultaneous quantification of acylcarnitine isomers containing dicarboxylic acylcarnitines in human serum and urine by high-performance liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2007.