Медиатека

Моноклональные антитела: от производства до применения


1. Что такое антитела?

Антитела – один из важнейших инструментов современного биолога. Их применяют во многих научных и медицинских исследованиях, поэтому в наше время невозможно вообразить работу лаборатории без использования антител. Что же они из себя представляют?
Антитела, или иммуноглобулины, – это семейство гликопротеинов, выделяемых иммунной системой в ответ на инфекцию, попадание ядов и чужеродных частиц в организм. Каждое антитело распознает определенный антиген, специфически связываясь с эпитопом на его поверхности – уникальным элементом антигена, или антигенной детерминантой, – по принципу «ключ-замок». Связавшись с антигеном, антитело либо нейтрализует его, либо активирует другие компоненты иммунной системы, чтобы уничтожить чужеродное вещество 1,3.


Рис.1. Строение антитела.

Антитела состоят из двух тяжелых и двух легких цепей, образуя Y-образную форму. Цепи делятся на вариабельные (V-домен) и константные домены (С-домен). Антигенсвязывающий сайт сформирован вариабельными доменами тяжелых и легких цепей. Это обеспечивает огромное разнообразие антител, что позволяет распознавать множество различных антигенов.
У млекопитающих различают 5 классов антител по типу тяжелых цепей: lgM, lgG, lgA, lgD, lgE. Они отличаются друг от друга функциями и особенностями структуры, такими как заряд, аминокислотный состав и содержание углеводного компонента. Структурные различия позволяют разным классам иммуноглобулинов функционировать при разных типах и на определенных стадиях иммунного ответа 1,3.


Рис.2. Схема строения 5 классов антител.

2. Поликлональные и моноклональные антитела. Способы получения.

При попадании антигена в кровь В-лимфоциты вырабатывают спектр разнообразных антител, распознающих различные детерминанты на его поверхности. Такие антитела называются поликлональнами. Поликлональные антитела – это гетерогенное семейство антител, вырабатываемых разными клонами плазматических клеток к различным участкам одного и того же антигена.
Поликлональные антитела широко используются в лабораторных исследованиях, однако у них есть определенные недостатки. В частности, спектр антител может различаться в разных поликлональных препаратах. Это означает, что прекрасно работающий состав будет с большой вероятностью утерян после смерти животного-донора: организм нового иммунизированного животного может по-другому реагировать на антиген и давать другой спектр поликлональных антител. К тому же, их нельзя применять для более детальных исследований, когда нужны отдельные антитела, связывающиеся с определенным эпитопом. Так появилась необходимость получать препараты моноклональных антител, специфичных лишь к одной антигенной детерминанте. В отличие от поликлональных антител, они происходят от единственного клона плазматической клетки 2.

И поли- и моноклональные антитела востребованы в современных исследованиях, но имеют разное применение. Моноклональные антитела используют в прикладной науке для отработанных методик и стандартных задач (изготовление лекарств, иммунодиагностика и проч.). Поликлональные антитела нужны для фундаментальных исследований. Например, для поиска вариантов белка, если неизвестно, какой именно эпитоп открыт для связывания с антителами. Их также иногда используют в иммунодиагностике в связи с низкой стоимостью получения.


Рис.3. Различия моноклональных и поликлональных антител.

Так как путем иммунизации животных получать моноклональные антитела невозможно, для их синтеза ученые решили выращивать отдельные клоны плазматических клеток in vitro. Однако оказалось, что клетки в культуре погибают задолго до того, как может осуществиться синтез иммуноглобулинов. Никто не мог продлить их жизнь на срок, достаточный для того, чтобы успеть получить препарат моноклональных антител, пока Жорж Келер и Сезар Мильштейн не догадались создать гибрид плазматической и опухолевой клеток в 1975 году 4. Дело в том, что клетки опухоли бессмертны, в отличие от плазматических клеток, деление которых ограничено пределом Хейфлика (примерно 50 делений) 5. Такой гибрид – гибридома – и его клоны наследуют от плазматической клетки способность к синтезу антител, а от опухолевых – бессмертие. Гибридомы могут неограниченно продуцировать однородную смесь моноклональных антител.
После получения гибридом необходимо отобрать нужные клоны из смеси неслившихся клеток и гибридов неверного состава. Для этого плазматические клетки изначально сливают с клетками миеломы, у которых отсутствует резервный путь синтеза нуклеотидов, что делает их чувствительными к среде НАТ (гипоксантин, аминоптерин, тимидин). Существует два пути синтеза нуклеотидов: основной и резервный. Аминоптерин блокирует основной путь синтеза нуклеотидов, поэтому без резервного пути такие опухолевые клетки и их гибриды погибают в среде, которая его содержит. В то же время, не слившиеся плазматические клетки или их гибриды погибают, поскольку их продолжительность жизни ограничена. Следовательно, остаются только гибридомы, получившие бессмертие от опухолевых клеток и резервный путь от лимфоцитов 2.


Рис.4. Схема получения моноклональных антител.

Для отбора нужных гибридом, полученные клетки рассеивают в отдельные ячейки в 96-луночных плашках и проверяют на наличие нужных антител. Для гарантии качества процедуру могут повторить несколько раз. Таким образом, должны быть отобраны только клоны, продуцирующие моноклональные антитела необходимой специфичности. Далее их можно получать in vitro (культивируя клоны в культуральной среде) или in vivo (прививая клоны мышам).
Стоит понимать, что получение гибридом – это трудоемкий, длительный и творческий процесс. Сохранить клоны одной клетки и получить устойчивую линию – задача не из легких. Часто нужные гибридомы не выживают в культуральной среде, а в некоторых случаях синтезируемый белок может быть для них токсичен, поэтому синтез идет медленно или не идет вообще.
В последние годы развитие генной инженерии и других областей науки привело к разработке методик получения синтетических антител in vitro без иммунизации животных. Например, для синтеза рекомбинантных антител получают необходимый фрагмент ДНК, а затем экспрессируют его с помощью фаговых, клеточных или рибосомных диплеев. Они имеют ряд преимуществ: можно синтезировать антитела нужной аффинности и специфичности, снизить затраты, повысить постоянство и чистоту препарата 3.


Рис.5. Схема получения рекомбинантных антител.

Моноклональные антитела могут быть выработаны против почти любого антигена. Именно поэтому они широко используются в исследовательских, диагностических и терапевтических целях.

3. Применение антител в методах иммунодиагностики.

Иммуноферментный анализ (ИФА) — это метод качественного и количественного определения различных соединений путем образования комплекса антиген-антитело. Один из компонентов комплекса конъюгирован с ферментом, который окрашивается в ходе реакции с хромогенным субстратом. Таким образом, можно определить количество окрашенного продукта, а, соответственно, и анализируемого вещества.

В связи с многообразием объектов исследования, реагентов и условий проведения анализа существует большое количество вариантов ИФА. Однако любой вариант содержит основные стадии:
1. Образование иммунного комплекса исследуемого вещества и антитела.
2. Связывание меченого ферментом конъюгата с иммунным комплексом.
3. Трансформация ферментной метки в регистрируемый сигнал.


Рис.6. Варианты иммуноферментного анализа.

В прямом варианте антиген определяют непосредственно специфичным антителом, меченым ферментом. При непрямом способе первичное антитело, связанное с антигеном, определяют вторичным антителом, меченым ферментом. Первичные антитела вырабатываются против определяемого антигена, связываются с ним напрямую и ни с чем не конъюгированы. Вторичные антитела вырабатываются против первичных и конъюгированы с меткой (в данном случае фермент), то есть первичные антитела выступают антигеном для вторичных.
При использовании метода «сэндвич» иммобилизованные антитела связываются с антигеном при нанесении образца в лунку. Возможен также и непрямой вариант сэндвича. При конкурентном ИФА определяемые антигены или антитела конкурируют с аналогичными мечеными антителами или антигенами за места связывания с сорбентом6.

Вестерн-блоттинг, или вестерн-блот, — это метод определения специфичных белков в образце. Денатурированные белки разделяют по размеру электрофорезом в полиакриламидном геле. После этого их переносят на нитроцеллюлозную или PVDF мембрану и детектируют заданный белок с помощью специфичных к нему антител. Вестерн-блот используется в молекулярной биологии, биохимии, генетике и других естественно-научных дисциплинах 7.


Рис.7. Схема вестерн-блоттинга.

Иммунофлуоресцентный анализ (МФА) — это метод качественного и количественного определения антигенов в препаратах клеток и тканей с помощью антител, меченых флуоресцентными маркерами. Образование комплекса антиген-антитело затем определяется с помощью флуоресцентного сигнала. Широко применяется в материаловедении и медико-биологических областях.


Рис.8. Варианты иммунофлуоресцентного анализа.

Различают прямой и непрямой методы МФА. При прямом на препарат наносят меченые красителем антитела против искомых антигенов. При непрямом сначала наносят первичные антитела, а затем против них вторичные антитела, конъюгированные флуоресцентными красителем. Несколько вторичных антител могут создать комплекс с первичным антителом, тем самым усиливая сигнал 8.

Иммуно-ПЦР — это сверхчувствительный метод выявления антигенов, который представляет собой комбинацию ИФА и ПЦР. В отличие от ИФА, для выявления комплекса антиген-антитело используется не фермент, а ДНК-метка. Это решает проблему низкой чувствительности ИФА, так как ПЦР помогает обнаружить даже очень малое количество ДНК. По аналогии с ИФА его реализуют в различных вариантах 9.


Рис.9. Варианты иммуно-ПЦР.

4. Применение антител в научной, медицинской и ветеринарной практике.

Моноклональные антитела нашли множество применений в современных исследованиях. Чаще всего их используют для количественного и качественно определения различных соединений, для очистки белков и связанных с ними молекул из клеточного лизата, а также для анализа экспрессии и локализации определенных белков в клетках и тканях 2,10,14. Исследователь сам выбирает необходимые антитела в зависимости от целей эксперимента. Так, например, производят антитела специально для ИФА или вестерн-блота.

В медицинской диагностике с помощью принципа взаимодействия антиген-антитело определяют концентрации специфических антител в крови, выявляя текущие или перенесенные инфекции и заболевания, а также гормоны и онкомаркеры. Например, развитие аутоиммунных заболеваний можно выявить с помощью анализа крови на антитела, направленные против эпитопов собственных клеток организма 2,10,14. Сейчас же актуально выявление антител к коронавирусу SARS-CoV-2, для чего существуют полные наборы реагентов.

Лекарственные препараты на основе моноклональных антител применяют для лечения ревматоидного артрита, рассеянного склероза, псориаза и многих видов рака. А пациентам, страдающим от полного или частичного отсутствия антител, обеспечивают пассивный иммунитет, вводя их искусственно 2,10,11,1214.
Чтобы предотвратить возникновение резус-конфликта при беременности, когда у резус-отрицательных женщин выделяются антитела против резус-положительного плода, им искусственно вводят анти-D иммуноглобулин 13.

Вслед за бурным развитием применения моноклональных антител в медицине им также нашли применение в иммунодиагностике, иммунотерапии и ветеринарии.
Компания Bio-X Diagnostics производит различные диагностические тест-системы для ветеринарии: экспресс-тесты для «полевой» диагностики, основанные на методе иммунохроматографии, тест-системы, основанные на методе ИФА и ПЦР, и моноклональные антитела.
Некоторые лаборатории разрабатывают моноклональные антитела для селективного нацеливания на белки, участвующие в патогенезе заболевания. Они обладают значительным потенциалом в качестве таргетной терапии таких хронических заболеваний, как остеоартрит, атопический дерматит или опухоли 12.

Несмотря на широкое применение, работа с антителамии – от их производства до применения – довольно трудоемка, поскольку на результат влияет множество факторов. Тем не менее, стремительное развитие фундаментальной и прикладной науки, а также методов производства моноклональных антител постепенно превращает их в чрезвычайно важный инструмент науки и медицины будущего.



Литература

1. Ярилин А. А. Иммунология. 2010.

2. Будчанов Ю.И. Моноклональные антитела: от создания до клинического применения. Клиническая онкогематология, 2016.

3. Альтшулер Е. П. и др. Получение рекомбинантных антител и способы увеличения их аффинности. Успехи биологической химии, 2010.

4. Köhler G. et al. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature, 1975.

5. Hayflick L. et al. The serial cultivation of human diploid cell strains. Wistnr Institute of Anatomy and Biology, 1961.

6. Katsi, K. Иммуноферментный анализ. Medach, 2019.

7. Mahmood T. et al. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences, 2012.

8. Immunofluorescence a simple overview. ONI, 2020.

9. Баркова И. А. и др. Метод иммуно-ПЦР в диагностике бактериальных и вирусных инфекций. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2019.

10. Siddiqui M. Z. Monoclonal antibodies as diagnostics; an appraisal. Indian Journal of Pharmaceutical Sciences, 2010.

11. Aleem A. et al. Evaluating And Referring Patients For Outpatient Monoclonal Antibody Therapy For Coronavirus (COVID-19) In The Emergency Department. StatPearls, 2021.

12. Rosenbaum M. The Science of Monoclonal Antibody Therapy: Introducing Canine Atopic Dermatitis Immunotherapeutic. 2016.

13. Urbaniak S.J. et al. RhD haemolytic disease of the fetus and the newborn. Blood reviews, 2000.

14. Свешников П.Г. и др. Введение в молекулярную иммунологию и гибридомную технологию. МГУ, 2006.