Медиатека

С тех пор, как в середине XX века стало понятно, что носителями генетической информации в любых организмах служат нуклеиновые кислоты (НК), одной из важнейших задач в молекулярной биологии стало извлечение из клеток ДНК и РНК. От качества и количества полученных препаратов НК зависит успех дальнейших манипуляций, таких как ПЦР, обратная транскрипция, клонирование, секвенирование и других. Очищенные НК используются в исследованиях структуры и функции генов, генной инженерии, диагностике генетических и инфекционных заболеваний и криминалистике. Способы выделения и очистки НК постоянно совершенствуются, с прицелом на повышение качества образцов, упрощение, ускорение и удешевление процесса.

Получение образцов НК состоит из четырёх основных этапов:

• разрушение клеток;
• удаление белков, липидов и обломков клеток;
• связывание/очистка НК из раствора;
• концентрирование НК ¹.

На первом этапе клетки подвергаются химическому или физическому воздействию, которое приводит к разрыву их оболочек. Выбор метода зависит от типа клеток и от того, насколько важно избежать фрагментации молекул НК. Химические методы, основанные на использовании осмоса, ферментов и детергентов, в целом мягче, чем физические, когда клетки разрушают с помощью ультразвука или давления. Концентрирование НК на последнем этапе проводят, как правило, методом переосаждения с 70%-ным спиртом (этанолом или изопропанолом), в котором НК агрегируют. Подходы ко второму и третьему этапам более разнообразны. Именно им в первую очередь посвящена статья.

«Жидкофазное» выделение НК

Классический и до сих пор распространённый способ выделения НК – фенол-хлороформный ² (Рис. 1). Клеточный лизат или гомогенат тканей обрабатывают фенолом, хлороформом и изоамиловым спиртом в пропорции 25:24:1 – фенол нужен для денатурации белков, включая нуклеазы, хлороформ растворяет жиры, а изоамиловый спирт уменьшает пенообразование и защищает хлороформ от окисления. Полученный двухфазный раствор интенсивно перемешивают, а затем центрифугируют для разделения фаз. В нижнюю (органическую) фазу попадают липиды и жирные кислоты, на границе раздела фаз оседают белки, а в верхней (водной) фазе остаются нуклеиновые кислоты. При низком pH ДНК также оказывается в органической фазе, тогда как РНК остаётся в водной, что можно использовать для раздельного выделения ДНК и РНК ¹. Преимущества метода – его дешевизна и отсутствие необходимости в сложном оборудовании. Недостатки – относительная трудоёмкость, низкий выход нуклеиновых кислот и необходимость их дополнительной очистки, высокий риск потери образцов, а также токсичность фенола и хлороформа.

Рис. 1. Этапы выделения НК с помощью фенол-хлороформного метода.

Данный способ относится к группе «жидкофазных» подходов к выделению НК. К ней относятся и менее популярные подходы. Например, градиентное центрифугирование с хлоридом цезия и бромистым этидием или экстракция бромидом цетилтриметиламмония, а также подходы с ограниченным использованием – такие как щелочное выделение, традиционное для плазмидной ДНК, но не подходящее для больших молекул НК, и выделение НК с хелатирующей смолой Chellex, применяемое главным образом в судебной медицине ¹. Одна из недавних разработок – ферментативное термозависимое выделение НК, при котором удаление белков из клеток с разрушенными стенками происходит с помощью термофильной протеиназы ЕА1 ³ (Рис. 2). Этот метод поддаётся автоматизации, отличается быстротой и пригоден для выделения НК из минимального количества биоматериала.

Рис. 2. Этапы выделения НК с помощью ферментативного термозависимого метода.

«Твердофазное» выделение НК

«Твёрдофазные» подходы к выделению НК более эффективны по сравнению с «жидкофазными» и гораздо шире используются. Принцип их действия заключается в адсорбции растворённых НК на различных матрицах с последующей элюцией. Эти подходы используются в подавляющем большинстве готовых наборов для выделения НК, например, в наборах от компании Magen. Сорбентом, как правило, служат силикаты, но также находят применение целлюлоза, анионообменные смолы и другие субстраты ¹. «Предтечей» таких подходов можно считать старую методику, при которой ДНК из раствора, полученного после обработки фенол-хлороформом, извлекают с помощью стеклянной палочки, наматывая на неё прилипающие к ней нити ⁴. Механизм использования силикатов заключается в том, что в щелочных условиях и при высоких концентрациях солей отрицательно заряженные молекулы НК избирательно связываются с положительно заряженными ионами на поверхности силикатных матриц ⁵. На заключительном этапе выделения НК элюируют из матрицы водой или гипоосмотическим раствором.

Рис. 3. Этапы выделения НК на колонках с силикатной мембраной.

Один из самых популярных способов выделения НК – на колонках с силикатной мембраной ¹ (Рис. 3) Применение таких колонок позволяет упростить сложный многостадийный процесс выделения НК из растворов до обычной фильтрации. Колонки состоят из резервуара и мембраны под ними. В резервуар помещается клеточный лизат или другая жидкость, содержащая НК, которые будут адсорбированы на мембране. Сначала жидкость пропускают через мембрану, что можно делать как с помощью центрифуги (в этом случае используются специальные пробирки), так и с помощью вакуумного насоса (Рис. 4А, 4Б.). Затем колонки переносят в чистые пробирки, куда собирают НК после элюции. Преимущества метода – несложность выполнения, чистота получаемых образцов НК и воспроизводимость. Недостатки – необходимость в дополнительном оборудовании. Кроме того, выделение коротких фрагментов ДНК этим методом затруднено ¹. В портфолио компании Magen представлен большой выбор для выделения для выделения НК из разных источников на колонках под общим названием HiPure.

Рис. 4. Центрифужная пробирка (А) и вакуумное устройство (Б) с колонками.

Ещё один способ «твёрдофазного» выделения НК – на магнитных частицах ¹ (Рис. 5) В качестве матрицы в этом случае используются магнитные частицы, покрытые каким-либо связывающим веществом (например, целлюлозой, сефадексом, специфичными нуклеотидами), либо целиком состоящие из магнитоактивного композитного материала ^{6, 7, 8}. После связывания НК с сорбентом пробирку с частицами подносят к магниту для осаждения частиц. Отделив частицы от жидкой фазы, НК элюируют подходящим раствором.

Рис. 5. Этапы выделения НК на магнитных частицах.

Данный метод имеет те же самые преимущества, что и выделение НК на колонках, не требует наличия центрифуги и легко поддаётся автоматизации ¹. В продуктах компании Magen под общим названием MagPure используются композитные суперпарамагнитные частицы, содержащие силанольные и карбоксильные группы, с которыми связываются НК (Рис. 6).

Рис. 6. Фотография магнитной частицы, используемой для выделения НК.

Выделение НК из различных источников требует использования различных реагентов и адсорбирующих матриц. Так, например, если необходимо выделить ДНК или РНК из целых клеток или культур тканей, важно использовать такой метод разрушения клеток, который не приведёт к разрушению НК. При выделении плазмидной ДНК следует избегать её загрязнения геномной ДНК. При работе с биологическими жидкостями основной проблемой является низкая концентрация НК в образцах, а значит, высокая вероятность потери материала. Самый простой для исследователей способ решения любой из подобных задач – использование готовых наборов, в большом количестве представленных на рынке. Компанией Magen разработаны наборы HiPure и MagPure для выделения циркулирующих НК, НК из крови, клеток и свежих тканей, вирусных, растительных, и микробных НК, микроРНК и плазмид, а также НК из образцов тканей, зафиксированных в парафине. Кроме того, Magen предлагают наборы для очистки НК из растворов, включая реакционные смеси, и агарозных гелей, и серии реактивов для хранения образцов НК при комнатной температуре.

В тех случаях, когда исследователи располагают небольшим количеством образца, возникает необходимость извлечь из него одновременно ДНК, РНК и белки. Наиболее распространённый метод, применяемый для этого, заключается в использовании тризола – раствора, основными компонентами которого являются тиоцианат гуанидина, ацетат натрия, фенол и хлороформ ¹⁰. Тризол выполняет несколько функций: он способствует разрушению клеток, стабилизирует РНК и позволяет разделить РНК, ДНК и белки в различных фазах при центрифугировании ¹. К недостаткам метода, помимо уже упомянутой токсичности фенола и хлороформа, относится то, что образцы ДНК, которые можно получить с его помощью, загрязнены, фрагментированы и плохо растворяются, а значит, ограничены в дальнейшем использовании. Одна из разработок компании Magen – наборы AllPure для одновременной очистки ДНК, РНК и белков из одного образца на центрифужной колонке.

Автоматизация выделения НК

Исследование генов с диагностическими целями всё шире используется в медицине, количество анализов постоянно растёт. Поэтому всё более актуальным становится использование автоматических систем очистки НК. Автоматизация процесса позволяет обрабатывать множество образцов одновременно, причём делать это в стандартизированных условиях, с высокой скоростью и точностью ¹. Принцип действия многих таких систем – извлечение НК из жидкой фазы с помощью магнитных частиц (Рис. 7). Однако процесс автоматической очистки НК, при всех его преимуществах, имеет слабые места – он требует развитой лабораторной инфраструктуры и может быть недостаточно чувствительным по отношению к малокопийным мишеням ¹. Компания Magen предлагает наборы, предназначенные для использования в универсальной автоматической системе KingFisher™ ⁹.

Рис. 7. Схема работы автоматических экстракторов НК на основе магнитных частиц в общем виде.

В то же время, автоматические станции выделения Auto-Pure от компании Allsheng совместимы с реагентами любых производителей, позволяют исключить человеческий фактор и повысить сходимость результатов. Auto-Pure 96 подходит для научно-исследовательских и медицинских центров, лабораторий и компаний, которые занимаются диагностикой COVID-19, селекцией, NGS, производством праймеров для ПЦР и предоставляют услуги по секвенированию. В линейке также представлены модели Auto-Pure Mini и Auto-Pure S32, которые не занимают много места и работают автономно, без подключения к ПК.

Литература

1. Ali N. et al. Current nucleic acid extraction methods and their implications to point-of-care diagnostics. BioMed Research International, 2017.

2. Sambrook J., Russell D.W. Purification of nucleic acids by extraction with phenol:chloroform. CSH Protocols, 2006.

3. MicroGEM's Automated Solution: the PDQeX Nucleic Acid Extractor. MicroGEM.

4. Храмцова Е.А., Максимова Н.П. Молекулярная генетика: Метод. указания к лабораторным М75 занятиям по спецпрактикуму. БГУб, 2003.

5. Vogelstein B., Gillespie D. Preparative and analytical purification of DNA from agarose. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1979.

6. Zhang M. et al. Adsorption of DNA by using polydopamine modified magnetic nanoparticles based on solid-phase extraction. Analytical Biochemistry, 2019.

7. Qie F. et al. Nucleic acid from beans extracted by ethanediamine magnetic particles. Journal of Food Science and Technology, 2015.

8. Zhang Z. et al. Synthesis of novel porous magnetic silica microspheres as adsorbents for isolation of genomic DNA. Biotechnology Progress, 2006.

9. KingFisher™ Purification System. Thermo Fisher Scientific.

10. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry, 1987.