Медиатека

01.06.2022

Система CRISPR/Cas – от идеи к практике

За последние 10 лет уникальный инструмент редактирования генома CRISPR/Cas9 произвел научную революцию в биологии и медицине как быстрый, дешевый и точный метод, обладающий огромным потенциалом.

Нередко учёные подглядывают за природой, а потом используют находки в своих целях. Так произошло и с системой СRISPR/Cas. Ее история связана с открытием и изучением адаптивного иммунитета прокариот, основанном на использовании коротких РНК, закодированных в особых последовательностях генома (СRISPR-локусах), которые направляют нуклеазу Cas для создания сайт-специфичных надрезов в чужеродной ДНК. При попадании в бактерию вирусных частиц (бактериофагов) с помощью системы СRISPR/Cas происходит разрезание вирусной ДНК, небольшие кусочки которой сохраняются в геноме бактерии в специальных областях – спейсерах – и предназначены для распознавания и защиты при повторном инфицировании.

История изучения этого процесса берет своё начало в Японии в 1987 году. Учёные университета Осака впервые заметили¹ необычный паттерн ДНК в геноме E. coli, который имел 5 коротких идентичных повторов, разделенных уникальными спейсерами. В то время ученые не могли предсказать биологические функции этих элементов из-за недостатка информации. В 1993 году испанский учёный Франсиско Мохика обратил более пристальное внимание на странные палиндромные последовательности в геноме архей и даже дал им название - SRSR (Short Regularly Spaced Repeats)^2,3. Дальнейшие исследования показали, что такие паттерны характерны для большинства архей и многих видов бактерий. Впоследствии их переименовали в CRISPR (Сlustered Regularly Interspaced Short Palindromic) – кластерно расположенные короткие палиндромные повторы.

В 2002 году было замечено⁴, что СRISPR-последовательностям всегда сопутствуют белок-кодирующие гены, названные cas (акроним от CRISPR-ASsociated), функция которых оставалась пока неясной.

К 2005 году было накоплено достаточно данных, свидетельствующих о соответствии спейсеров фрагментам ДНК из геномов бактериофагов, и сразу 3 научные группы опубликовали сходные результаты, выдвинув предположение о связи CRISPR-локусов с механизмом антивирусной защиты бактерий⁵. Позднее это предположение подтвердили экспериментально.

В 2007 году группа микробиологов во главе с Филиппом Хорватом инфицировала бактериофагами важную промышленную культуру Streptococcus thermophilus, которую используют для ферментации молока⁶. Часть этих бактерий выжила и получила устойчивость к вирусам. Оказалось, что выжившие бактерии коллекционировали фрагменты генома вирусов в спейсерных последовательностях и использовали их для последующей защиты. При удалении спейсеров некогда устойчивые штаммы теряли способность защищаться от инфицирования. Эта же группа ученых изучала гены cas и показала ключевую роль белка Cas9 в расщеплении чужеродной ДНК.⁷

Дальнейшие исследования раскрыли подробности функционирования элементов CRISPR/Cas в иммунной системе прокариот, а несколько научных групп придумали, как использовать их для редактирования ДНК других организмов.

В 2012 году коллаборация ученых, включая Дженнифер Дудну и Эммануэль Шарпантье⁸, получивших в 2020 году Нобелевскую премию, а также группа Виргиниуса Шикшниса⁹ реконструировали систему СRISPR/Cas и доказали возможность ее использования для направленного разрезания ДНК in vitro. Следующим шагом стало исследование возможностей системы на живых клетках. Спустя 3 три года независимые лаборатории опубликовали статьи с результатами редактирования геномов млекопитающих, включая человеческий. С этого момента количество публикаций о редактировании геномов разных организмов (дрожжей, нематод, плодовых мушек, мышей, обезьян и др.) с помощью CRISPR/Cas молниеносно росло, а сама система зарекомендовала себя как уникальную технологию, позволяющую исследователям быстро и просто изменять последовательности ДНК^6,10.

Принципы работы системы редактирования CRISPR/Cas9

На сегодняшний день изучены многочисленные вариации природных систем CRISPR/Cas, а модификация одной из них (из Streptococcus pyogenes) привела к созданию технологии редактирования геномов. Она известна как СRISPR/Cas9 и широко используется учеными со всего мира.

Система состоит из двух ключевых молекул – эндонуклеазы Cas9, которая осуществляет двухцепочечный разрез ДНК, и молекулы гидовой РНК (гРНК), которая направляет комплекс с Cas9 в необходимый участок генома. гРНК состоит из двух частей: константной, которая образует каркас для связывания Cas9, и части из 20 нуклеотидов, комплементарных последовательности целевой ДНК (протоспейсеру). Сайт-мишень в ДНК также включает две части: протоспейсер и примыкающий к нему короткий, но очень важный PAM-мотив (Protospacer-Adjacent Motif), без которого невозможно разрезание ДНК.

После объединения гРНК с Cas9 их активный комплекс находит в геноме целевой участок ДНК, связывается с последовательностью PAM и раскручивает двухцепочечную спираль, а комплементарная последовательность в гРНК связывается с одной из цепей. Если происходит эффективное связывание, эндонуклеазные домены Cas9 расщепляют обе цепи ДНК на 3-4 основания выше PAM-мотива.

После того, как происходит разрезание ДНК, запускается система репарации клетки. Далее есть два варианта развития событий – может произойти негомологичное соединение концов (при этом образуются вставки или делеции неопределенного числа нуклеотидов, что может привести к нарушениям в структуре и работе функциональных элементов генома) или гомологичная рекомбинация, в ходе которой можно осуществить вставку необходимой исследователю последовательности ДНК.^9,11

Как и любой метод, технология CRISPR/Cas9 не лишена недостатков, основной из которых – вероятность нецелевого связывания в разных местах генома. Однако современные модификации метода позволяют свести эту вероятность к минимуму. Например, использование двух белков Cas9, каждый из которых делает одноцепочечный разрыв, и т.д.

Есть ли альтернативы?

До появления методов редактирования генома для создания мутаций использовались мутагены (этилметансульфонат, ультрафиолет, радиация), однако это приводило к случайным ненаправленным мутациям¹². Достижения генной инженерии позволили создать гораздо более точные способы внесения направленных изменений в геномы живых организмов. Наиболее известные из них, помимо CRISPR/Cas9, это использование нуклеаз ZFN и TALEN. Такие подходы медленные, трудозатратные, очень дорогие и, кроме того, сложные в применении, так как для каждой новой мутации необходимо конструировать и экспрессировать новый измененный белок¹³. Несмотря на это, данные методы позволили сильно расширить понимание геномного редактирования и получить значимое количество результатов, а TALEN в простейшем случае обладает большей точностью, чем СRISPR/Cas9. Тем не менее, последний фактически вытеснил другие подходы, так как намного проще в использовании, универсален и может быть адаптирован для большинства живых систем¹⁴.

Области применения

Технология СRISPR/Cas9 очень быстро внедрилась в самые разные области исследований и сейчас применяется для множества целей – нокаута и редактирования генов на уровне клеток и целых организмов¹⁵, регуляции транскрипции генов, редактирования эпигенома, высокопроизводительного геномного скрининга и многих других.^16,17,18,19

Пожалуй, наибольший интерес вызывает использование СRISPR/Cas9 в клинических и терапевтических целях. Технология произвела революцию в этой области, позволив точно имитировать различные модификации ДНК (от точечных мутаций до хромосомных транслокаций) на клеточных линиях и животных, создавая модели генетических заболеваний.

Возможности СRISPR/Cas9 позволяют применять ее в генной терапии для нокаутирования (выключения) или редактирования «сломанных» генов. Это может избавить от многих заболеваний, имеющих генетическую компоненту, например, рака. В 2016 году китайский пациент стал первым человеком, получившим инъекцию клеток, модифицированных системой СRISPR/Cas9²⁰. В иммунных клетках крови пациента был инактивирован ген, кодирующий необходимые для деления раковых клеток белок, что привело к замедлению роста агрессивной опухоли.

Использование СRISPR/Cas9 уже показало свою эффективность в терапии таких генетических заболеваний, как бета-талассемия и серповидноклеточная анемия – сейчас эти протоколы проходят клинические испытания.^21,22,23

На клеточных и животных моделях СRISPR/Cas9 применили для исправления генетических дефектов, лежащих в основе таких заболеваний, как нейропатия Лебера²⁴, миодистрофия Дюшена²⁵, муковисцидоз²⁶, катаракта и других²⁷. Также система CRISPR/Cas9 оказалась эффективной в борьбе с бактериальными и вирусными инфекциями (включая ВИЧ-1²⁸, гепатит Б²⁹ и др.) и паразитарными заболеваниями³⁰.

Большинство манипуляций можно проводить на соматических клетках, однако редактирование генома на зародышевых клетках вызывает ряд этических вопросов и на данный момент незаконно в большинстве стран. Тем не менее, в 2018 году китайский ученый Цзянькуй Хэ заявил о рождении первых в мире детей, геномы которых были отредактированы, в обход запретов, на стадии эмбрионов. Эта новость всполошила общественность, вызвав новую волну бурных обсуждений.

Редактирование организмов с помощью СRISPR/Cas9 активно внедряется в биотехнологии и сельское хозяйство. Компании и лаборатории по всему миру работают над созданием растений, более устойчивых к заболеваниям и вредителям, содержащих больше полезных веществ, а также продуктов, не вызывающих аллергических реакций³¹.

СRISPR/Cas9 позволяет оптимизировать производство малых молекул и белков в промышленности. Например, компания Synthetic Genomics смогла значительно повысить выход липидов, продуцируемых водорослями, тем самым увеличив объем биодизеля, который можно из них получить³².

Самое необычное применение СRISPR/Cas9 – воссоздание вымерших видов, включая странствующих голубей и мамонтов. Такие эксперименты уже проводятся в Гарварде.³³

Несмотря на то, что в области геномного редактирования остаётся много неизвестного, СRISPR/Cas9 подарил учёным возможность быстро и просто изменять организмы для нужд человечества и стал ключиком к решению многих важных вопросов.