Медиатека

Валидация антител к остаточным белкам клетки-хозяина

Валидация антител к остаточным белкам клетки-хозяина

Предлагаем вам узнать больше о процессе и методах валидации антител для оценки белков клетки-хозяина с помощью ИФА. Белки клетки-хозяина (БКХ) – это основная примесь в биотехнологических препаратах, полученных с использованием генетически модифицированных клеток. Комбинирование методов 2-D электрофореза и вестернблоттинга позволяет валидировать антитела всего за 2 дня.


Зачем использовать 2-D электрофорез (2-DE) и вестерн-блоттинг для оценки антител, используемых для определения БКХ методом ИФА?


Если вы хотите быть уверены в результатах оценки БКХ методом ИФА, то используемые поликлональные антитела должны связывать максимально возможное количество белков-антигенов. Это указано в рекомендациях для аналитических методик и критериев приемлемости биологических/биотехнологических средств (ICH Q6B).

Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) советует использовать для валидации антител методы 2-DE и вестерн-блоттинга, которые традиционно применяются для анализа сложных белковых смесей благодаря возможности разделять белки по изоэлектрической точке и молекулярному весу.

При этом методы 1-DE и вестерн-блоттинга недостаточно информативны для валидации антител. Однако другие методы можно использовать только после консультации с FDA. Они должны быть такими же чувствительными и иметь сопоставимую с 2-DE и вестерн-блоттингом разрешающую способность.

Каково минимальное рекомендуемое значение соотношения процента пятен, выявленных анти-БКХ антителами, к общему числу пятен, обнаруженных с помощью высокочувствительного окрашивания общего белка?


На этот счет рекомендаций нет, но предполагается, что чем выше соотношение, тем лучше антитела к БКХ. Некоторые исследователи считается, что значение должно быть порядка 80% для пригодности антител к БКХ в ИФА. Значения ниже 80% могут быть приемлемы, если будет доказано, что примеси, которые не удаётся обнаружить используемым методом квалификации антител, не очищаются вместе с конечным продуктом. В таком случае примеси должны контролироваться дополнительными методами.

Bio-Rad предлагает надежное решение для достоверной и быстрой оценки антител к БКХ на основе 2-DE и вестерн-блоттинга, которое позволяет менее чем за 2 дня принять решение о пригодности антител к использованию в мониторинге БКХ методом ИФА.

Протокол валидации антилел к остаточным белкам клетки-хозяина методом 2-D электрофореза


Шаг протокола Продукт Назначение
Подготовка образца



Набор для селективной преципитации ReadyPrep™ 2-D Cleanup Kit
  • Удаляет ионные примеси, например, детергенты и липиды.
  • Концентрирует разбавленные образцы.
  • Улучшает воспроизводимость и разрешение 2-D фореза.
Набор реагентов для подготовки образцов и стрипов ReadyPrep™ 2-D Starter Kit
  • Включает все необходимое для регидратации, фокусирования и уравновешивания стрипов.
2-D электрофорез



Стрипы ReadyStrip™ IPG
  • Для изоэлектрофокусирования на стрипах с иммобилизованным градиентом pH.
  • Доступно множество диапазонов pH.
Система для изоэлектрофокусирования PROTEAN® i12 IEF
  • Система для изоэлектрофокусирования в 12 стрипах с независимыми источниками питания для каждой дорожки стрипа.
Камера для вертикального электрофореза на 12 гелей Criterion™ Dodeca™
Готовые гели Criterion™ TGX™
Стандарты Precision Protein Plus™
  • Для разделения белков по молекулярной массе после изоэлектрофокусирования.
Краситель для белков SYPRO Ruby или Oriole™
  • Для анализа эффективности разделения. Не влияет на дальнейший протокол переноса.
Гель-документирующая система ChemiDoc™ MP или ChemiDoc™
  • Для визуализации и анализа данных.
Перенос белков на мембрану


Система для быстрого полусухого переноса Trans-Blot® TURBO™
  • Для быстрого высокоэффективного переноса на PVDF-мембрану.
Набор PVDF мембран для переноса Trans-Blot® TURBO™ RTA Midi LF PVDF с низкой аутофлуоресценцией
Визуализация


Субстрат Clarity™ Western ECL или Clarity™ MAX Western ECL
  • Детектирование белков на уровне фемтограмм с помощью HPR-конъюгированных вторичных антител.
  • Продолжительность сигнала до 24 часов.
Краситель для блота SYPRO Ruby Protein Blot
  • Для полного окрашивания блота.
Гель-документирующая система ChemiDoc™ MP или ChemiDoc™
  • Для визуализации и анализа данных.
Анализ результатов


Программное обеспечение для 2-D гелей PDQuest™
  • Позволяет автоматически определять пятна, проводить сравнение, наложение и анализ.