Медиатека

Предлагаем вам узнать больше о процессе и методах валидации антител для оценки белков клетки-хозяина с помощью ИФА. Белки клетки-хозяина (БКХ) – это основная примесь в биотехнологических препаратах, полученных с использованием генетически модифицированных клеток. Комбинирование методов 2-D электрофореза и вестернблоттинга позволяет валидировать антитела всего за 2 дня.

Если вы хотите быть уверены в результатах оценки БКХ методом ИФА, то используемые поликлональные антитела должны связывать максимально возможное количество белков-антигенов. Это указано в рекомендациях для аналитических методик и критериев приемлемости биологических/биотехнологических средств (ICH Q6B).

Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) советует использовать для валидации антител методы 2-DE и вестерн-блоттинга, которые традиционно применяются для анализа сложных белковых смесей благодаря возможности разделять белки по изоэлектрической точке и молекулярному весу.

При этом методы 1-DE и вестерн-блоттинга недостаточно информативны для валидации антител. Однако другие методы можно использовать только после консультации с FDA. Они должны быть такими же чувствительными и иметь сопоставимую с 2-DE и вестерн-блоттингом разрешающую способность.

На этот счет рекомендаций нет, но предполагается, что чем выше соотношение, тем лучше антитела к БКХ. Некоторые исследователи считается, что значение должно быть порядка 80% для пригодности антител к БКХ в ИФА. Значения ниже 80% могут быть приемлемы, если будет доказано, что примеси, которые не удаётся обнаружить используемым методом квалификации антител, не очищаются вместе с конечным продуктом. В таком случае примеси должны контролироваться дополнительными методами.

Bio-Rad предлагает надежное решение для достоверной и быстрой оценки антител к БКХ на основе 2-DE и вестерн-блоттинга, которое позволяет менее чем за 2 дня принять решение о пригодности антител к использованию в мониторинге БКХ методом ИФА.

Протокол валидации антилел к остаточным белкам клетки-хозяина методом 2-D электрофореза

Шаг протокола	Продукт	Назначение
Подготовка образца	Набор для селективной преципитации ReadyPrep™ 2-D Cleanup Kit	Удаляет ионные примеси, например, детергенты и липиды. Концентрирует разбавленные образцы. Улучшает воспроизводимость и разрешение 2-D фореза.
	Набор реагентов для подготовки образцов и стрипов ReadyPrep™ 2-D Starter Kit	Включает все необходимое для регидратации, фокусирования и уравновешивания стрипов.
2-D электрофорез	Стрипы ReadyStrip™ IPG	Для изоэлектрофокусирования на стрипах с иммобилизованным градиентом pH. Доступно множество диапазонов pH.
	Система для изоэлектрофокусирования PROTEAN® i12 IEF	Система для изоэлектрофокусирования в 12 стрипах с независимыми источниками питания для каждой дорожки стрипа.
	Камера для вертикального электрофореза на 12 гелей Criterion™ Dodeca™ Готовые гели Criterion™ TGX™ Стандарты Precision Protein Plus™	Для разделения белков по молекулярной массе после изоэлектрофокусирования.
	Краситель для белков SYPRO Ruby или Oriole™	Для анализа эффективности разделения. Не влияет на дальнейший протокол переноса.
	Гель-документирующая система ChemiDoc™ MP или ChemiDoc™	Для визуализации и анализа данных.
Перенос белков на мембрану	Система для быстрого полусухого переноса Trans-Blot® TURBO™	Для быстрого высокоэффективного переноса на PVDF-мембрану.
	Набор PVDF мембран для переноса Trans-Blot® TURBO™ RTA Midi LF PVDF с низкой аутофлуоресценцией
Визуализация	Субстрат Clarity™ Western ECL или Clarity™ MAX Western ECL	Детектирование белков на уровне фемтограмм с помощью HPR-конъюгированных вторичных антител. Продолжительность сигнала до 24 часов.
	Краситель для блота SYPRO Ruby Protein Blot	Для полного окрашивания блота.
	Гель-документирующая система ChemiDoc™ MP или ChemiDoc™	Для визуализации и анализа данных.
Анализ результатов	Программное обеспечение для 2-D гелей PDQuest™	Позволяет автоматически определять пятна, проводить сравнение, наложение и анализ.

Скачать статью про валидацию антител к БКХ