Медиатека

Контаминация – что это?

Контаминация – это проблема, о которой не всегда принято говорить, но которая существует и затрагивает все лаборатории, работающие с ПЦР. Контаминация происходит за счет загрязнения рабочих зон, оборудования и одежды сотрудников различными типами ДНК и РНК и приводит к ложноположительным результатам ПЦР. Это серьезная проблема для лабораторий любого профиля и критическая – для клинических и криминалистических организаций. Каждый год в PubMed появляется около 100 статей о проблеме ДНК-контаминации, однако публикаций о том, как с ней бороться, очень мало (рис. 1).

Главным образом, загрязнения попадают в воздух из пробирок, планшетов, с рук операторов, а затем переносятся по всей лаборатории и за ее пределы и оседают на одежде сотрудников, дверных ручках, холодильниках и других контактных предметах или остаются в воздухе в виде аэрозоля. Также контаминация может произойти при проведении некоторых лабораторных процедур, например при выделении ДНК из геля для клонирования или при автоклавировании. Среди основных типов контаминирущих ДНК и РНК можно выделить:

• Геномную ДНК;
• Ампликоны;
• Бактериальную/плазмидную ДНК;
• кДНК (редко);
• вирусную РНК.

Чтобы контаминация лаборатории не стала причиной ошибочных результатов ПЦР, ее нужно своевременно выявить и ликвидировать.

Как проверить лабораторию на наличие контаминации?

Самый важный момент, который позволит вовремя выявить контаминацию, – это постановка отрицательных контролей. Если они не проходят, то первым делом нужно поменять реагенты и пластик и использовать другой ламинарный бокс для повторной постановки реакции. Если после этого отрицательные контроли проходят, следует провести локальную деконтаминацию изначального ламинарного бокса и утилизировать контаминированные реагенты. Однако если после смены пластика, реагентов и ламинарного бокса отрицательные контроли не проходят, значит произошла более серьезная контаминация: поверхностная или воздушная. Определение типа контаминации позволяет оценить сам масштаб необходимых мер: при контаминации воздуха необходима самая сложная – объемная – деконтаминация всего помещения.

Для анализа контаминации поверхностей нужно сделать с них смывы: нанести ПЦР-буфер на проверяемую поверхность и несколько раз ресуспендировать, а затем использовать полученный раствор в качестве матрицы для ПЦР. Чтобы проанализировать чистоту воздуха, необходимо сделать посевы из воздуха: открыть пробирку с ПЦР-буфером и подержать ее на воздухе полчаса, закрыть пробирку и использовать этот буфер в качестве ПЦР-матрицы. Если нет возможности проверить наличие ДНК в воздухе и сделать смывы с поверхностей для оценки их чистоты (например, негде поставить заведомо “чистые” реакции), следует сразу начинать деконтаминацию.

Что делать, если вы обнаружили контаминацию?

Если на каком-либо этапе проверки лаборатории на наличие контаминации вы все-таки ее выявили, то нужно с этой проблемой бороться. Советы от эксперта в области деконтаминации позволят вам грамотно и своевременно устранить контаминацию и не допустить ее повторного появления.

• Проводите проверочные постановки реакций в другом помещении, если есть такая возможность;
• Смените реагенты и пластик, а также лабораторную одежду. Помните, что одежда является одним из источников контаминации и ее миграции;
• Деконтаминируйте дозаторы и ламинарный бокс. Несмотря на то что многие дозаторы автоклавируются, это, к сожалению, не поможет, потому что автоклавирование не разрушает ДНК, а в лучшем случае частично ее фрагментирует;
• Если есть какие-то признаки мигрирующей контаминации (переносимой по воздуху или операторами, на оборудовании или через дозаторы), то необходимо как можно более оперативно использовать профессиональные средства для деконтаминации;
• Используйте облучатели-рециркуляторы с фильтрами и с высокой производительностью независимо от того, подозреваете ли вы поверхностную контаминацию или контаминацию воздуха;
• Проводите обработку помещения бактерицидными лампами с циклическим таймером. Одной обработки в день недостаточно;
• Убедитесь в том, что вентиляция в здании работает нормально. В случае серьезных воздушных контаминаций, задача номер один – очистить воздух. Данная процедура занимает примерно сутки. Сначала необходимо очистить воздух рециркуляторами, а также обработать поверхности УФ-излучением;
• Если после первых этапов деконтаминации (рециркуляторами, УФ или профессиональными средствами, примененными локально на поверхности) остаются высокие концентрации контаминирующей ДНК, то необходимо переходить к объемной аэрозольной деконтаминации всего помещения. Она проводится ТОЛЬКО профессиональными средствам. Если не откладывать и делать всё в правильном порядке, даже от самой тяжелой контаминации с загрязненным воздухом можно избавиться всего за несколько дней. В случае наиболее частых локализованных и умеренных контаминаций при использовании профессиональных средств вся процедура, как правило, занимает несколько минут.

И помните, ни в коем случае нельзя пользоваться спиртом, он осаждает ДНК на поверхностях, но никогда ее не разрушает и осложняет ее смывку (как это характерно для любых осадков нуклеиновых кислот после спирта). При использовании 70% и 96%-этанола Cq сдвигается всего на 0.5-2 цикла – даже чистая вода обладает лучшими деконтаминационными свойствами. Также не надо надеяться на хлорку и перекись водорода. Эти средства не решат вашу проблему, и нужно пользоваться профессиональными средствами для ДНК-деконтаминации.

Компания «Биомедицинские инновации» разработала высокоэффективное средство DNArid для борьбы с этой проблемой. В таблице показано, насколько эффективен данный реагент по сравнению с аналогичными продуктами других производителей, а также насколько традиционные средства (хлорсодержащие дезинфицирующие средства и перекись водорода в различных концентрациях) уступают профессиональным.

Средство DNArid применяется как при уже случившейся контаминации, так и для ее предотвращения при еженедельной или ежедневной обработке рабочих зон и оборудования. Реагент не токсичен, безопасен для окружающей среды, не коррозивен и может применяться на любых поверхностях. Благодаря своей безопасности DNArid полностью решает проблему лабораторий, в которых помещения для ПЦР и электрофореза находятся не в разных зданиях или хотя бы не на разных этажах. Плановая обработка дверных ручек и других предметов (в том числе лабораторной одежды и обуви), с которыми контактируют операторы, снижает до нуля риск внесения контаминации в чистую зону.

После того, как деконтаминация проведена, нужно поставить отрицательные контроли, провести смывы с поверхностей и оценить качество воздуха, чтобы подтвердить, что деконтаминация прошла успешно. Когда вы убедились, что контаминация элиминирована, нужно минимизировать риски новой контаминации.

Что делать, чтобы предотвратить контаминацию?

Для того чтобы предотвратить контаминацию, важно действовать комплексно. Деконтаминации традиционными средствами или облучения ультрафиолетом недостаточно. Несколько простых правил и советов помогут вам избежать проблему ДНК-контаминации:

• Проводите рутинную деконтаминацию – регулярная обработка профессиональными средствами, например DNArid, стоит недорого в пересчете на каждую защищенную реакцию ПЦР и обходится намного дешевле последствий контаминации и затрат на ее устранение;
• Используйте облучатели-рециркуляторы с высокой производительностью и фильтрами;
• Проводите облучение помещения ультрафиолетом по таймеру несколько раз в сутки;
• Убедитесь в функционировании системы вентиляции или используйте альтернативные решения – фильтровые блоки с HEPA-фильтром для подачи воздуха через окно;
• Проводите деконтаминацию дозаторов с их разборкой и полной обработкой;
• Вовремя обслуживайте и очищайте амплификаторы и центрифуги;
• Регулярно деконтаминируйте автоклавы – источник фрагментарной ДНК;
• Обеспечивайте регулярную смену HEPA-фильтров ламинарных боксов и обслуживание их подрешеточных зон;
• Проводите микробиологический контроль воздуха – это простой и недорогой способ определить, оптимально ли работают системы вентиляции, очистки воздуха, УФ-облучения и правильно ли проводится уборка. Для этого можно использовать уже готовые чашки Петри со средой, специально разработанной для этих целей компанией «Биомедицинские инновации»;
• Используйте только заведомо чистую воду для всех процедур – и для ПЦР, и для пост-обработки поверхностей после деконтаминации, например воду, обработанную ДЭПК, в спрей-флаконе;
• Обеспечьте качественную утилизацию отходов: после проведения амплификации нужно не допустить повреждения пробирок и планшетов, а стерилизация автоклавированием не должна сама становиться источником контаминации;
• В лаборатории должен быть запас неконтаминированных салфеток, дистиллированной воды, наборов реагентов и пластика, а также лабораторной одежды;
• Сотрудники лаборатории должны быть обучены всем правилам работы в ПЦР-лаборатории, в том числе в части вопросов контаминации и деконтаминации.

Подводя итог, можно отметить, что проблему контаминации возможно решить в достаточно короткие сроки, при этом важно действовать комплексно, применяя методы как химической, так и физической деконтаминации. Чтобы не допустить повторного появления контаминации, нужно руководствоваться несколькими простыми правилами работы в лаборатории, и тогда ложноположительные результаты не будут угрожать вашим экспериментам. Желаем вам новых открытий и продуктивной работы, в которой нет места контаминации!