ДНК-полимераза Phire Hot Start II

Артикул: F122S

Производитель: Thermo Fisher Scientific

Цена в валюте / в рублях

Фасовка:

$142.61

9 693.62 р.

Описание

Количество фермента – 200 мкл (F-122S, достаточно для проведения 200 экспериментов при объеме реакционной смеси 50 мкл) или 1000 мкл (F-122L, достаточно для проведения 1000 экспериментов при объеме реакционной смеси 50 мкл).

В упаковку также входят:

  • 5-тикратный буфер Phire;
  • 100%-ный диметилсульфоксид (ДМСО).

ДНК-полимераза Phire Hot Start II представляет собой уникальный фермент, созданный для применения в стандартной и высокопроизводительной полимеразной цепной реакции (ПЦР) и конкурентноспособный по отношению к Taq-полимеразам, используемым в ПЦР с «горячим стартом». ДНК-полимераза Phire Hot Start II значительно эффективнее этих ферментов (скорость элонгации цепи ДНК - 10-15 с на 1000 пар нуклеотидов), обладает в 2 раза более высокой точностью действия по сравнению с ними, стабильна, способна амплифицировать протяженные ДНК-фрагменты (до 7,5 тысяч звеньев) с высоким выходом. Перечисленные свойства ДНК-полимеразы Phire Hot Start II обеспечиваются специально введенным в ее состав уникальным доменом, способным связывать двуцепочечную ДНК и увеличивающим процессивность действия фермента.

Термостабильную ДНК-полимеразу Phire Hot Start II экспрессируют в клетках E. coli, несущих плазмиду, в которую клонирован ген ДНК-полимеразы архей. Фермент катализирует синтез ДНК в направлении с 5'- на 3'-конец, обладает незначительной корректирующей 3'-5'-экзонуклеазной активностью и не проявляет свойств 5'-3'-экзонуклеазы. В процессе реакции образуются фрагменты ДНК с «тупыми» концами.

dUTP и dITP не являются субстратами ДНК-полимеразы Phire Hot Start II, она не способна вести синтез ДНК при наличии этих модифицированных нуклеозидов в составе матрицы или праймера. Фермент не содержит примесей экзо- и эндонуклеаз.

Отличительной особенностью ДНК-полимеразы Phire Hot Start II является её необычная структура. Кроме области, ответственной за полимеразную активность, фермент содержит обратимо связанный с ним специфический белок Affibody® (Nord et al., Nature Biotechnology, 1997, v. 15, p. 772-777). Белок Affibody® ингибирует синтез ДНК-фрагментов полимеразой и её 3'-5'-корректирующую активность при температуре окружающей среды, что предотвращает образование неспецифических продуктов, деградацию матрицы и праймеров. При повышенной температуре происходит диссоциация белка Affibody® из комплекса с ДНК-полимеразой Phire Hot Start II, приводя к полному восстановлению полимеразной активности фермента без каких-либо дополнительных стадий в процессе ПЦР.

Белок Affibody® экспрессируют в клетках E. coli.

Буфер для хранения ДНК-полимеразы Phire Hot Start II:
20 мМ Трис-HCl (рН 7,4 при 25 °С), 100 мМ КCl, 1 мМ ДТТ, 0,1 мМ ЭДТА, стабилизаторы, 200 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина, 50% глицерина.

Условия транспортировки – сухой лед, условия хранения: -20 °С.

5-тикратный буфер Phire (F-524) содержит 7,5 мМ MgCl2, что обеспечивает оптимальную финальную концентрацию MgCl2 - 1,5 мМ - в реакционной смеси.

При синтезе ДНК-фрагментов с высоким содержанием GC-пар в реакционную смесь рекомендуется добавлять 3% диметилсульфоксида.

Внимание! Содержание в реакционной смеси ДМСО понижает температуру гибридизации праймеров (10% ДМСО - на 5,5–6,0 °С). Температура плавления ДМСО – 18-19 °С.

Рекомендации для проведения ПЦР.

  • Все растворы после размораживания тщательно перемешать и осадить капли центрифугированием.
  • При подготовке смеси для проведения ПЦР (табл. 1) не требуется помещать пробирки в баню со льдом. Оптимальная концентрация каждого из dNTP в реакционной смеси – 200 мкМ.
  • Следует помнить, что ДНК-полимераза Phire Hot Start II позволяет получать только фрагменты ДНК с «тупыми» концами.

Таблица 1. Состав смеси для проведения ПЦР

 
Объем смеси Финальная концентрация
50 мкл 20 мкл
Н2O добавить
до 50 мкл
добавить
до 20 мкл
 
5Х Буфер Phire 10 мкл 4 мкл
10 мМ dNTP 1 мкл 0,4 мкл 200 мкМ каждого
Праймер А х мкл
х мкл 0,5 мкМ
Праймер В х мкл х мкл 0,5 мкМ
ДНК-матрица* х мкл х мкл  
(ДМСО, при необходимости) (1,5 мкл) (0,6 мкл) (3%)
Полимераза Phire Hot Start II 1 мкл 0,4 мкл  

* Количество ДНК-матрицы при проведении ПЦР: 1 пг – 10 нг на 20 мкл реакционной смеси для плазмидных ДНК, ДНК фага лямбда или BAC ДНК; 10-100 нг на 20 мкл реакционной смеси для геномных ДНК со сложной вторичной структурой; не более 10% смеси, содержащей кДНК, от конечного объема смеси для ПЦР.

Внимание! Условия проведения ПЦР с участием ДНК-полимеразы Phire Hot Start II отличаются от протокола ПЦР с использованием стандартных ДНК-полимераз (табл. 2). Денатурацию проводят при 98 °С. Для определения оптимальной температуры гидридизации праймеров следует пользоваться инструкцией и калькулятором, размещенными на сайте www.thermoscientific.com/pcrwebtools. Время элонгации не должно превышать 10-15 c на 1000 нуклеотидных звеньев.

Таблица 2. Рекомендуемые условия ПЦР.

Этап Двухстадийный протокол Трехстадийный протокол Количество циклов
Температура,°С Время, с Температура,°С Время, с
Первоначальная денатурация 98 30 98 30 1
Денатурация 98 5 98 5 25-35
Гибридизация праймеров - - х 5
Элонгация 72 10-15 с на 1000 нуклеотидных звеньев 72 10-15 с на 1000 нуклеотидных звеньев
Финальная элонгация 72
4
60 72
4
60 1

Дополнительная информация о препарате доступна на сайте Thermo Fisher Scientific:



Вы можете воспользоваться пробником на 20 реакций

Модификации

Товар с ценой по запросу можно также разместить в корзину. Наш менеджер свяжется с Вами и уточнит цену. Заказ будет оформлен только в том случае, если Вас устроят все условия.

Описание

Артикул

Цена

Кол-во

Сумма

ДНК-полимераза Phire Hot Start II

F122L

$650.51 44 217.05 р. 44 217.05 р. 650.51 44217.051179 44217.051179 RUB

$0

0 р.
ДНК-полимераза Phire Hot Start II

F122S

$142.61 9 693.62 р. 9 693.62 р. 142.61 9693.615269 9693.615269 RUB

$0

0 р.
ДНК-полимераза Phire Hot Start II

F122

$0

Итого: $0

0 р. Заказать

Здесь вы можете увидеть расходные материалы для данного оборудования

Здесь вы можете увидеть комплектующие для данного оборудования