Современные решения для трансфекции клеток

Основой для любых генно-инженерных манипуляций с клетками человека и животных является трансфекция – процесс введения в клетки чужеродной нуклеиновой кислоты. В зависимости от поставленной задачи в клетку можно вводить плазмидную ДНК, малые интерферирующие РНК (siRNA), микроРНК (miRNA), малые РНК, образующие шпильки (shRNA), а также белки.

Трансфекцию используют в экспериментах по нокаутированию и регуляции экспрессии генов, для введения в клетку генов активаторов и репрессоров транскрипции, нуклеаз, флуоресцентных белков и т.д.

Важными характеристиками трансфекции является её эффективность (% клеток, в которые проник трансфекционный материал) и жизнеспособность клеток после трансфекции.

Основные методы трансфекции клеток:

  • Лентивирусная трансфекция. Нужная последовательность ДНК встраивается в геном лентивируса, который проникает в клетку благодаря взаимодействию поверхностных вирусных белков с цитоплазматической мембраной
  • Электропорация. Под действием электрического поля в мембране клеток образуются поры, через которые может проникнуть чужеродная нуклеиновая кислота/белок
  • Трансфекция с помощью катионных липидных частиц. Отрицательно заряженная ДНК/РНК взаимодействует с положительно заряженными липидными частицами, которые проникают через мембрану клеток путём гидрофобных взаимодействий с мембраной.

Компания Life technologies является одним из крупнейших поставщиков реагентов и приборов для трансфекции. Самыми популярными продуктами являются электропоратор Neon® и реагенты Lipofectamine® для трансфекции с помощью катионных липидных частиц.

С протоколами работы с реагентами Lipofectamine® и электропоратором Neon® можно подробно ознакомиться на сайте компании Life Technologies.

Трансфекция с помощью катионных липидов Lipofectamine®

Реагенты Lipofectamine® существуют на рынке уже более 25 лет и используются в ведущих лабораториях многих стран мира.

Принцип трансфекции с помощью реагентов Lipofectamine®:

Липидные частицы Lipofectamine® состоят из положительно заряженной «головки» и двух гидрофобных «хвостов». С помощью головки частицы взаимодействуют с фосфатными группами нуклеиновых кислот, в то время как хвосты обеспечивают прохождение ДНК/РНК через клеточную мембрану по принципу эндоцитоза (Рис.1).

Схема трансфекции с помощью реагентов Lipofectamine
Рис. 1 Схема трансфекции с помощью реагентов Lipofectamine®

Возможные недостатки различных методик трансфекции:

  • Низкая эффективность
  • Невысокая воспроизводимость результатов
  • Цитотоксичность
  • Трудоёмкость

Преимущества трансфекции с помощью катионных липидов Lipofectamine®:

  • Уникально высокая эффективность трансфекции
  • Применимость к широкому спектру эукариотических клеток
  • Высокая воспроизводимость результатов
  • Отсутствие цитотоксичности
  • Простота в использовании

Более того, некоторые клеточные линии трансфецируются исключительно с помощью катионных липидных частиц (ход трансфекции представлен на Рис. 2).

При выборе подходящего трансфекционного агента необходимо учитывать вид трансфекционного материала. Существуют универсальные реагенты (Lipofectamine® 2000 и 3000), которые подходят как для ДНК, так и для РНК. Новейшие реагенты разработаны специально для трансфекции клеток малыми интерферирующими (siRNA) и микроРНК (miRNA) (Lipofectamine® RNAiMAX) или мРНК (Lipofectamine® MessengerMAX™).

Кроме того, большое значение имеет тип трансфецируемых клеток. Стволовые клетки и клетки первичных культур, как правило, более требовательны к трансфекционным агентам, чем стабильные клеточные линии. Рекомендации по применению реагентов для конкретных клеточных линий можно найти по ссылке.

Ход эксперимента по трансфекции клеток с помощью Lipofectamine
 
Рис. 2 Ход эксперимента по трансфекции клеток с помощью Lipofectamine®

Lipofectamine®

Самый первый из появившихся на рынке катионно-липидный реагент для трансфекции ДНК в эукариотические клетки. Высокое качество трансфекции подтверждается десятками тысяч цитирований, начиная с выпуска продукта в 1993 году. Совместно с реагентом PLUS™ Lipofectamine® успешно трансфецирует такие клетки как BHK-21, NIH 3T3, COS-1, фибробласты, кератиноциты, HT-29, MRC-5 и SK-BR3.

Lipofectamine

Lipofectamine® LTX

Самый эффективный трансфекционный реагент для работы с трудно-трансфецируемыми, чувствительными клетками и первичными клеточными культурами. Преимущество перед другими реагентами заключается в уникально высоком показателе жизнеспособности клеток после трансфекции (>90%). Эффективность трансфекции можно дополнительно повысить, используя Lipofectamine® LTX в комбинации с реагентом PLUS™.

Lipofectamine® LTX

Lipofectamine® 2000

Усовершенствованная версия реагента Lipofectamine® подходит для большинства клеточных линий. Широко применяется в качестве универсального трансфецирующего реагента (подходит для плазмидной ДНК, а также для экспериментов по нокдауну генов с помощью малых интерферирующих РНК (siRNA) и плазмид, кодирующих микроРНК (miRNA) и малые РНК, образующих шпильки (shRNA)). Подходит для котрансфекции ДНК и siRNA. Характеризуется наивысшим уровнем экспрессии рекомбинантного белка в трансфецированных клетках. Эффективно работает в присутствии сыворотки, что снимает необходимость смены среды после трансфекции. Эффективность трансфекции для некоторых клеточных линий достигает 99%.

Lipofectamine® 2000

Lipofectamine® 3000

Применение самых современных нанотехнологий позволило создать реагент, значительно превосходящий по эффективности реагент Lipofectamine® 2000. Более продуктивная трансфекция была показана для 50 клеточных линий из 63 (для большинства трудно поддающихся трансфекции клеток эффективность трансфекции увеличилась в 10 раз!). Высокая производительность трансфекции позволяет снизить количество реактива и, таким образом, уменьшить потенциальную токсичность для клеток. Lipofectamine® 3000 рекомендуется использовать при работе с системами TALEN и CRISPR как самый надежный и эффективный из существующих трансфекционных реагентов.

Lipofectamine® 3000

Lipofectamine® RNAiMAX

Наилучшим образом подходит для экспериментов по нокдауну генов с помощью РНК-интерференции, так как разработан специально для введения в клетки синтетических малых интерферирующих РНК (siRNA) и микроРНК (miRNA). Катионные липиды данного реагента обладают специфичностью к малым РНК. Благодаря крайне низкой цитотоксичности реагента в широком диапазоне концентраций, возможна оптимизация протокола для решения конкретных задач. Повышенная эффективность трансфекции позволяет использовать более низкие концентрации РНК и увеличивает вероятность успешного нокдауна гена.

Lipofectamine® RNAiMAX

Lipofectamine® MessengerMAX ™

Инновационный реагент разработан специально для внедрения в клетки матричной РНК (мРНК). Преимущество трансфекции мРНК заключается в более быстрой экспрессии белков, отсутствии риска интеграции трансфецируемого материала в геном и независимость эффективности трансфекции от стадии клеточного цикла. Для некоторых задач мРНК является оптимальным трансфекционным материалом. Например, введение в клетку мРНК нуклеаз CRISPR увеличивает эффективность разрезания ДНК более чем в 10 раз. Реагент обладает высокой эффективностью при трансфекции нейронов и широкого спектра первичных клеточных линий.

Lipofectamine® MessengerMAX ™

Реагент PLUS™

Реагент используется совместно с катионными липидами Lipofectamine® для повышения эффективности трансфекции. Добавления реагента PLUS™ позволяет в 2 раза снизить количество трансфецируемой нуклеиновой кислоты и липидов. Кроме того, использование реагента расширяет спектр эффективно трансфецируемых клеточных линий (например, значительно увеличивается эффективность трансфекции клеток BHK-21 и NIH 3T3).

Реагент PLUS™

Трансфекция с помощью электропоратора Neon®

Электропорация является одним из наиболее распространённых методов трансфекции благодаря своей высокой эффективности. Принцип метода (Рис.3).

Клетки и трансфецируемый материал помещаются в проводящую среду, к которой на несколько микросекунд прикладывается высоковольтное электрическое поле. В результате в мембране клетки образуются поры, достаточного диаметра для прохождения сквозь них нуклеиновых кислот и белков. Поры остаются открытыми около 30 с. За это время трансфекционный материал проникает в клетку.

Принцип электропорации
Рис. 3 Принцип электропорации

Ключевые параметры электропорации:

  • Сила импульса
  • Длительность импульса
  • Количество импульсов

Недостатки трансфекции с помощью традиционных электропораторов:

  • Низкая выживаемость клеток из-за интенсивного электролиза в трансфекционной камере, приводящая к перепадам pH и выбросу токсичных ионов металлов и хлора
  • Необходимость оптимизации протокола для каждого типа клеток

Электропоратор Neon™ компании Life technologies (Рис.4) разработан с учётом всех недостатков метода электропорации.

Трансфекционная камера Neon™ (Рис. 5) представляет собой тонкий капилляр с маленькой поверхностью электродов. Камера такой конфигурации обладает электрическим сопротивлением, в 200 раз большим, чем традиционная кювета, что минимизирует электролиз и значительно повышает выживаемость клеток. Кроме того, образующееся в капилляре однородное электрическое поле без краевых эффектов формирует в клетках одинаковые по размеру поры, благодаря чему достигается максимальная эффективность трансфекции.
Преимущества трансфекции с помощью прибора Neon®:

  • Высокая эффективность (до 90% во многих клетках, включая трудно-трансфецируемые, стволовые клетки и клетки первичных культур)
  • Возможность доставки в клетки как ДНК и РНК, так и белков
  • Возможность варьирования количества клеток в широком диапазоне (от 2 х 104 до 6 х 106 на реакцию)
  • Единый набор реагентов для трансфекции всех типов клеток
  • Возможность оптимизации условий эксперимента с помощью изменения параметров электропорации
  • Простота в использовании

Капилляр Neon™ одновременно является и трансфекционной камерой, и наконечником дозатора Neon™, что сокращает протокол электропорации до трёх простых шагов:

Набор для трансфекции Neon™ (электропоратор, штатив, дозатор, наконечники и реагенты
Рис. 4 Набор для трансфекции Neon™ (электропоратор, штатив, дозатор, наконечники и реагенты)

Трансфекционная камера Neon™
Рис. 5 Трансфекционная камера Neon™ (наконечник дозатора Neon™)

Капилляр Neon™ одновременно является и трансфекционной камерой, и наконечником дозатора Neon™, что сокращает протокол электропорации до трёх простых шагов:

Капилляр Neon™ одновременно является и трансфекционной камерой, и наконечником дозатора Neon™, что сокращает протокол электропорации до трёх простых шагов

Специально для прибора Neon® разработано большое количество протоколов, оптимизированных для трансфекции разных типов клеток. Подробнее...


Возврат к списку

Подпишитесь и получайте дополнительные скидки