23

май

ПЦР в реальном времени – что выбрать: зонды TaqMan или интеркалирующий краситель SYBR Green?

Анализируете экспрессию генов, исследуете однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) или работаете с микроРНК? Тогда Вам наверняка знаком метод ПЦР в реальном времени. В нем используется два типа реагентов – интеркалирующие красители (например, SYBR green) и зонды (золотой стандарт – TaqMan). Но какая технология оптимальна для вашего исследования?
Разберемся в данной статье.


Сравнение методов:

Детекция с помощью SYBR Green
Детекция с помощью TaqMan
Принцип
Используется краситель SYBR Green, связывающийся с двухцепочечной НК, для детекции ПЦР-продукта по мере накопления в процессе ПЦР
Используется флуоресцентный зонд, специфически связывающийся с целевым участком ДНК, для детекции таргетной последовательности по мере накопления в процессе ПЦР
Специфичность Средняя* Высокая
Чувствительность
(изначальное количество копий ДНК в образце)
Низкая/средняя* 1–10 копий
Специфичность Средняя* Высокая
Воспроизводимость результатов Средняя* Высокая
Возможность мультиплексного анализа
Наличие готовых наборов
Необходимость пользовательского дизайна, оптимизации условий реакции
Стоимость
Приложения
     Экспрессия генов;
     Количественное определение ДНК (детекция патогенов);
     Иммунопреципитация хроматина (ChIP)
     Экспрессия генов;     Анализ сигнальных путей;
     Количественное определение ДНК (детекция патогенов);
     Иммунопреципитация хроматина (ChIP);
     Вариация числа копий генов (CNV);
     Исследование микроРНК и малых РНК;
     Детекция мутаций;      Анализ белков;
     Мультиплексный анализ;      Цифровая ПЦР

*Зависит от качества матрицы и дизайна праймеров

Схема технологий:

ТЕХНОЛОГИЯ SYBR GREEN ТЕХНОЛОГИЯ TAQMAN
1. Подготовка реакции: Краситель SYBR green светится, связавшись с двухцепочечной ДНК. 1. Создание пробы: Флуоресцентный краситель (R) и гаситель (Q) присоединяются к 5’ и 3’ концу зонда TaqMan, соответственно.
2. Денатурация: В процессе разъединения цепей ДНК краситель SYBR green высвобождается и перестает флуоресцировать. 2. Присоединение зонда к ДНК: Проба присоединяется к целевому гену, но не флуоресцирует, так как свечение флуорофора невелируется гасителем.

3. Отжиг и элонгация: Праймеры отжигаются, ДНК-полимераза начинает достраивать цепи ДНК, синтезируется ПЦР-продукт. 3. Расщепление зонда: В процессе наращивания цепи ДНК-полимераза натыкается на зонд и расщепляет его, отделяя краситель от гасителя.
4. Полимеризация завершена: После того, как цепи ДНК достроились, SYBR green связывается с ними и начинает светить. 4. Элонгация завершена: Благодаря отсоединению от гасителя краситель начинает флуоресцировать.

SYBR и другие интеркалирующие красители

Малые молекулы, присоединяющиеся к двухцепочечной нуклеиновой кислотой, делятся на два типа:

  • Интеркаляторы;
  • Молекулы, связывающиеся с малой бороздкой ДНК (minor groove binders).

Независимо от способа связывания, молекулы должны обладать следующими свойствами для успешного использования в ПЦР в реальном времени:

  • Увеличение флуоресценции при связывании с двухцепочечной ДНК;
  • Не должны ингибировать ПЦР.

Принцип работы химии SYBR

Краситель SYBR детектирует продукт ПЦР путем связывания с двухцепочечной ДНК, образующейся в результате ПЦР.

Пошаговая схема технологии:

1. Когда SYBR добавляется к реакции, он мгновенно связывается со всеми двухцепочечными молекулами ДНК в образце.

2. В процессе ПЦР ДНК-полимераза амплифицирует таргетную последовательность, накапливая ПЦР-продукты.

3. Краситель SYBR связывается с каждой новой копией двухцепочечной ДНК.

4. По мере увеличения циклов ПЦР, увеличивается количество продукта ПЦР. SYBR связывается со всеми молекулами ДНК, таким образом, флуоресцентный сигнал растет пропорционально количеству амплифицированных ПЦР-продуктов.

ТЕХНОЛОГИЯ SYBR GREEN
1. Подготовка реакции: Краситель SYBR green светится, связавшись с двухцепочечной ДНК.
2. Денатурация: В процессе разъединения цепей ДНК краситель SYBR green высвобождается и перестает флуоресцировать.
3. Отжиг и элонгация: Праймеры отжигаются, ДНК-полимераза начинает достраивать цепи ДНК, синтезируется ПЦР-продукт.
4. Полимеризация завершена: После того, как цепи ДНК достроились, SYBR green связывается с ними и начинает светить.

Видео технологии:


Достоинства красителя SYBR:

  • Универсальность: возможно отслеживать накопление любой двухцепочечной ДНК;
  • Низкая стоимость: нет необходимости заказывать специфичную пробу, что снижает стоимость реакции (при условии, что подобраны оптимальный дизайн праймеров и условия эксперимента).

Недостатки красителя SYBR:

  • Главным недостатком является риск получения ложноположительных результатов, так как SYBR связывается со всеми двухцепочечными фрагментами ДНК, в том числе неспецифическими. Поэтому крайне важно аккуратно подбирать праймеры, которые не будут связываться с последовательностями, отличными от таргетной. Кроме того, после реакции Real-time ПЦР рекомендуется провести анализ кривых плавления (melt curve analysis) для проверки эффективности реакции ПЦР.

Более подробно об анализе кривых плавления (melt curve analysis):


Что еще следует учитывать

Важным моментом применения интеркалирующих красителей является то, что с одним двухцепочечным фрагментом ДНК может связываться несколько молекул красителя. Из этого следует, что интенсивность флуоресценции будет зависеть от длины амплифицируемого фрагмента. Иными словами, при одинаковой эффективности ПЦР-реакции, сигнал от более длинного ампликона будет интенсивнее, чем от короткого. Эта проблема решается флуоресцентным TaqMan зондом, при использовании которого, один флуорофор освобождается с одной синтезируемой последовательности, в независимости от ее длины.


Зонды TaqMan

Изначально для количественного определения ПЦР-продуктов использовались красители-интеркаляторы – молекулы со сродством к двухцепочечной ДНК. Главным недостатком такого метода является то, что краситель в этом случае связывается как с таргетными, так и с неспецифичными ПЦР-продуктами.

Разработка химии TaqMan

Новая эра в Real-time ПЦР наступила с разработкой наборов, использующих флуоресцентно-меченные пробы и Taq-полимеразу с 5’-экзонуклеазной активностью. Это позволило создать метод детекции только специфичных продуктов амплификации.

Пошаговая схема технологии:

1. Синтез олигонуклеотидного зонда с флуоресцентным красителем на 5’-конце и гасителем на 3’-конце. Благодаря особой конструкции зонда, гаситель расположен в непосредственной близости от красителя и гасит флуоресценцию последнего по механизму FRET (флуоресцентный резонансный перенос энергии). Таким образом, зонд в интактном состоянии не флуоресцирует.

2. При добавлении таргетной последовательности, к ней присоединяются зонд, а также немеченые праймеры, комплементарные последовательностям с обеих сторон от зоны посадки зонда. С них начинается амплификация ДНК. В процессе синтеза Taq-полимераза наталкивается на зонд и расщепляется его за счет своей 5’-экзонуклеазной активности.

3. В результате расщепления пробы:

  • Флуорофор пространственно разъединяется с гасителем и начинает светиться;
  • Проба удаляется с таргетной цепи ДНК, что позволяет амплифицировать комплементарную цепь до конца. Таким образом, проба не ингибирует процесс ПЦР.

4. С каждым циклом ПЦР все больше молекул флуорофоров отсоединяется от гасителя, что приводит к увеличению флуоресцентного сигнала пропорционально количеству амплифицированных ампликонов.

ТЕХНОЛОГИЯ TAQMAN
1. Создание пробы: Флуоресцентный краситель (R) и гаситель (Q) присоединяются к 5’ и 3’ концу зонда TaqMan, соответственно.

2. Присоединение зонда к ДНК: Проба присоединяется к целевому гену, но не флуоресцирует, так как свечение флуорофора невелируется гасителем.

3. Расщепление зонда: В процессе наращивания цепи ДНК-полимераза натыкается на зонд и расщепляет его, отделяя краситель от гасителя.

4. Элонгация завершена: Благодаря отсоединению от гасителя краситель начинает флуоресцировать.

Видео технологии:

Существует два типа TaqMan-проб:

  • TaqMan-проба с красителем TAMRA™, выступающем в качестве гасителя;
  • TaqMan-проба с нефлуоресцирующим гасителем NFQ (non-fluorescent quencher) и доменом MGB.

TaqMan-пробы с гасителем NFQ и MGB рекомендуются для дискриминации мутантных и нормальных аллелей в рамках аллель-специфической ПЦР, особенно в случае, когда длина TaqMan зонда превышает 30 пар нуклеотидов. TaqMan-проба с гасителем NFQ и MGB содержит:

  • Немеченый гаситель (NFQ) на 3’-конце: благодаря тому, что гаситель не флуоресцирует, амплификатор может с большей точностью определить вклад репортерного красителя в общую флуоресценцию;
  • Молекула, связывающаяся с малой бороздкой ДНК (MGB, minor groove binder) на 3’-конце: за счет более специфичного связывания молекула позволяет увеличить температуру плавления (Tm) пробы, позволяя использовать более короткие зонды без потери чувствительности.

Соответственно, в случае TaqMan MGB пробы, увеличена разница в Tm для специфически и неспецифически связанных проб, что позволяет четко дискриминировать аллели.

Более подробно о выборе гасителя:


Достоинства технологии TaqMan:

  • Специфичность: Флуоресцентный сигнал появляется только в случае специфической гибридизации пробы к таргетной последовательности;
  • Возможность мультиплекса: пробы могут быть мечены различными флуорофорами, что позволяет одновременно в одной пробирке амплифицировать и детектировать несколько мишеней;
  • Отсутствие необходимости пост-ПЦР-ной обработки, что позволяет экономить ресурсы.

Недостатки технологии TaqMan:

  • Главным недостатком является необходимость синтеза нового зонда для каждой новой таргетной последовательности.

Более подробно ознакомиться с различными наборами TaqMan и заказать нужные вам зонды можно здесь>>.

Если вам хочется ближе познакомиться с технологией ПЦР в реальном времени и разобраться в ее базовых понятиях, рекомендуем посмотреть серию коротких видео «Ask TaqMan», в которых доступным языком объясняются основные термины и ноу-хау Real-time ПЦР.


Возврат к списку

Подпишитесь и получайте дополнительные скидки