13

июл

Проточная цитометрия: принципы метода и практическое применение

Если вы попросите ученого или клинициста, работающего с культурами клеток, назвать наименее трудоемкий метод анализа клеточных популяций, дающий быстрый и информативный результат, ответ будет однозначным: проточная цитометрия.

Принципы проточной цитометрии

По-научному, проточная цитометрия, или flow cytometry – это метод регистрации оптических параметров находящихся в потоке клеток или частиц по сигналам светорассеяния и флуоресценции в режиме поштучного анализа.

Для фокусировки клеток в потоке жидкости используется гидродинамическое или акустическое фокусирование, с помощью которого клетки выстраиваются в потоке в ряд, одна за другой. В проточной ячейке клетки облучаются лазером, оптика цитометра собирает световой сигнал от клеток, а электроника преобразует и оцифровывает сигнал для дальнейшего анализа.

В проточной цитометрии измеряются следующие параметры:

  • прямое светорассеяние (рассеяние света под малым углом, FSC) для определения относительного размера клеток или частиц;
  • боковое светорассеяние (рассеяние света под прямым углом, SSC) для оценки неоднородности внутриклеточного содержимого клетки (например, размеры ядра и гранулярность цитоплазмы);
  • флюоресценция – для изучения клеточных маркеров с помощью меченных флюорохромными красителями антител к поверхностным и внутриклеточным компонентам клеток. При этом по интенсивности флюоресценции можно судить об экспрессии антигенов (количестве рецепторов) на клетках.




Схема проточного цитометра

Применение проточной цитометрии

Самое простое приложение проточной цитометрии – подсчет клеток и оценка их жизнеспособности. Для этого используются классические красители на жизнеспособность, например, наборы LIVE/DEAD kit от Thermo Fisher Scientific или Muse® Count and Viability Kit. Набор состоит из одного или нескольких красителей, которые позволяют отличить мертвые клетки или клетки с нарушенной целостностью клеточной мембраны от живых клеток.
Проточную цитометрию можно использовать для анализа клеточного цикла. Различные стадии клеточного цикла отличаются по содержанию ДНК в клетке. Наборы для анализа клеточного цикла содержат ДНК-связывающие красители, интенсивность флуоресценции которых пропорциональна количеству ДНК. С помощью гистограммы интенсивности флуоресценции можно выделить клетки в G0/G1, S и G2/M фазах клеточного цикла.
Анализ апоптоза основан на связывании Аннексина V с фосфотидилсерином на поверхности апоптотирующих клеток. На ранних стадиях апоптоза молекулы фосфотидилсерина перемещаются на внешнюю сторону клеточной мембраны и способны связываться с Аннексином V. На поздних стадиях апоптоза клетки теряют целостность клеточной мембраны и поглощают краситель, который иначе не смог бы проникнуть через клеточную мембрану.
analiz-apoptoza.jpg
Для анализа различных стадий апоптоза проводят определение активированных каспаз в сочетании с красителем, окрашивающим мертвые клетки.

Проточная цитометрия в иммунологии активно используется для иммунофенотипирования клеток крови, позволяет идентифицировать внутриклеточные белки, оценить степень цитотоксичности, и многое другое.


Субпопуляции Т-клеток периферической крови и поверхностные антигены, применяемые для их выявления
* только для научных исследований, не для клинической диагностики
Проточная цитометрия в клинической лабораторной диагностике

Достаточно быстро проточная цитометрия стала рутинным методом в диагностических лабораториях клиник.
На сегодняшний день проточные цитометры, зарегистрированные Росздравнадзором, в лабораторной диагностике активно используют для оценки иммунного статуса пациента (для этого используют такие поверхностные маркеры, как CD3, CD4, CD8, CD 19, CD 20, CD22 и т.д.), оценку иммунологического фенотипа нормальных и опухолевых клеток для своевременной постановки диагноза, а также отслеживание острых лейкозов в ходе лечения. Большой вклад проточная цитометрия внесла в диагностику гемобластозов.

pdf.jpg ПРОТОЧНАЯ ЦИТОМЕТРИЯ В КЛИНИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ

Реагенты для проточной цитометрии

Для работы на проточных цитометрах используются как клеточные красители, так и моноклональные антитела для проточной цитометрии для научных, так и клинических приложений. Антитела отличаются как по мишени и видоспецифичности, так и по конъюгированным с антителами флуоресцентным меткам.
В зависимости от конфигурации проточного цитофлюориметра (длин волн и количества лазеров и флуоресцентных каналов) можно создавать многоцветные панели из антител.

Основные правила составления многоцветных панелей.

Таблица 1. Флуорохромы, наиболее часто используемые для прямой конъюгации с моноклональными антителами

Флуорохромы Длина волны возбуждения, нм Эмиссия, нм
Флуоресцеинизотиоцианат (FITC) 488 525
Алекса Флуор 488 (Alexa Fluor 488) 488 525
Фикоэритрин (PE, R-PE, RD1) 488 575
ECD (PE-Texas Red)* 488 610
PC5 (PE/CY5)* 488 675
PC5.5 (PE/CY5.5)* 488 700
PE Alexa Fluor 700* 488 725
PC7 (PE/CY7) 488 790
Алофикоцианин (АРС) 633/635 680
Alexa Fluor 647 633/635 680
Alexa Fluor 700 633/635 725
APC Alexa Fluor 700* 633/635 725
APC7 (APC/CY7)* 633/635 790

Примечания: CY – цианин; * – тандемные флуоресцентные красители
Почему проточной цитометрии – быть

Сравнивая с молекулярными методами диагностики, главные преимущества проточной цитометрии — это возможность быстрой оценки большого количества параметров при относительной экономичности исследования. С другой стороны, многообразие реагентов и технологических решений (от самых простых клеточных анализаторов до проточных цитометров и цитометров с визуализацией) позволили значительно расширить как прикладные, так и диагностические возможности проточной цитометрии, делая ее одним из мощнейших методов клеточного анализа.


Возврат к списку

Подпишитесь и получайте дополнительные скидки