04

сен

Хемилюминесценция уходит в прошлое? 5 причин перейти на флуоресцентный вестерн-блоттинг

Впервые о вестерн-блоттинге – методе переноса белков из полиакриламидного геля на мембрану, заговорили почти 40 лет назад. Сегодня это один из самых широко используемых лабораторных методов определения и оценки количества белков. 

Общие принципы метода за прошедшие годы практически не изменились, а вот способы детектирования белков на мембране заметно эволюционировали. Радиоактивные и колориметрические методы детекции, долгое время использовавшиеся для анализа результатов вестерн-блоттинга, в свое время повсеместно заменила хемилюминесценция (ECL), гарантирующая исследователям высокую чувствительность при низкой токсичности реагентов. Изначально хемилюминесценцию детектировали с помощью фотографической пленки, но из-за низкого динамического диапазона (~1.8 порядка) и эмпирического (а значит, плохо воспроизводимого) подбора времени экспозиции от пленки начали отказываться в пользу документирующих систем с цифровой камерой. Добавить к этому низкую линейность люминесцентного сигнала и необходимость использования белков домашнего обихода для нормализации, и станет ясно, почему хемилюминесцентный вестерн-блоттинг до сих пор считают полуколичественным методом анализа (Zellner et al. 2008). 

В помощь ученым, не готовым на компромиссы, когда дело касается точного определения уровня экспрессии белков, был разработан метод флуоресцентного вестерн-блоттинга. Первым и основным преимуществом флуоресцентного детектирования стала прямая зависимость между интенсивностью флуоресценции флуорофора на вторичном антителе и экспрессией белка. Недооцененный в 1990-х, с развитием технологий цифровой визуализации и разработкой новых антител и наборов реагентов для работы с флуоресценцией с низким соотношением «сигнал-шум», метод флуоресцентного вестерн-блоттинга в последние годы начал приобретать все больше и больше поклонников.

Использование конъюгатов антител с флуорофорами, у которых различаются спектры эмиссии, позволяет проводить мультиплексное детектирование множества различных белков на одной мембране. Это значит, больше никаких мозаик из разрезанных мембран! Кроме того, мультиплексный подход позволяет разделять белки похожих видов (например, фосфорилированные или ацетилированные белки) и близких молекулярных масс.



Более яркие и чувствительные флуорофоры, изобретение последних лет, дадут фору обычным и составят достойную конкуренцию самым чувствительным хемилюминесцентным субстратам. Кроме того, гель-документирующие системы нового поколения делают возможным использование ближнего инфракрасного (NIR) диапазона эмиссии, сводя к минимуму аутофлуоресценцию мембраны. 

Флуорофоры не только стали ярче – они стали более фотостабильными. Сегодня блоты с флуоресцентными метками могут храниться месяцами без потери сигнала и эффективности.

И, наконец, обилие протоколов и рекомендаций по постановке эксперимента и выбору антител (например, (Silva and McMahon (2014) и Eaton et al. (2014)) делают разработку метода вестерн-блоттинга гораздо более простым и удобным процессом.



По данным статьи bioradiations.com.

Возврат к списку

Подпишитесь и получайте дополнительные скидки