06

фев

Эндонуклеазы рестрикции: виды, особенности, применение

Эндонуклеазы рестрикции нашли широкое применение в молекулярной биологии и генетической инженерии благодаря своему свойству узнавать и гидролизовать в ДНК определенные нуклеотидные последовательности. Эндонуклеазы рестрикции используются:

  • для получения препаратов ДНК, содержащих фрагменты с одинаковыми концевыми последовательностями нуклеотидов, имеющих известное строение;
  • для конструирования рекомбинантных молекул ДНК, состоящих из фрагментов, взятых из разных геномов;
  • для структурного анализа геномов.

Компания гарантирует высокое качество производимых ферментов под известным брендом Fermentas by Thermo Fisher Scientific. Все препараты проходят специальные тест-контроли, подтверждающие отсутствие в них примесей эндо- и экзонуклеаз и фосфатаз.

За единицу активности (е.a.) эндонуклеазы рестрикции принято количество фермента, необходимое для полного гидролиза 1 мкг ДНК за 60 мин в 50 мкл реакционной смеси при оптимальной температуре протекания реакции. Особенности функционирования той или иной эндонуклеазы рестрикции приведены в паспорте фермента.

Эндонуклеазы рестрикции для ускоренного гидролиза ДНК (FastDigest® Restriction Endonucleases) – уникальная серия препаратов, обеспечивающая удобство, простоту и скорость в работе. Один мкл любой эндонуклеазы рестрикции серии FastDigest® полностью гидролизует 0,2–1 мкг плазмидной, вирусной, геномной ДНК, продуктов ПЦР, синтетических ДНК-субстратов за 5–15 мин при 37°С. Эти ферменты не вызывают неспецифической деградации ДНК даже при длительном времени инкубации. Буферы для проведения реакции, время и температура инкубации универсальны для всех эндонуклеаз рестрикции серии FastDigest®. Это позволяет гидролизовать ДНК по нескольким участкам одновременно несколькими ферментами в одной пробирке без смены буфера и выделения субстрата, что значительно упрощает эксперимент и минимизирует время его проведения. Буфер FastDigest®Green содержит краситель, который не влияет на функционирование большинства ферментов нуклеинового обмена и позволяет наносить на гель непосредственно реакционную смесь.

Эндонуклеазы рестрикции для ускоренного гидролиза ДНК рекомендуется использовать:

  • для быстрого конструирования векторов для клонирования;
  • для экспресс-анализа клонов;
  • для гидролиза продуктов ПЦР;
  • для экспресс-поиска точечных мутаций;
  • для гидролиза геномной ДНК и ДНК-субстратов различной природы.

Все эндонуклеазы должны храниться -20°С, кроме Hin1II (прототип NlaIII), которая более стабильна при -70°С.

Изошизомерные и неошизомерные эндонуклеазы рестрикции, производимые различными фирмами, обладая одинаковой специфичностью, имеют различное происхождение и могут иметь различные оптимальные условия для функционирования, различную «чувствительностью» к метилированию, неспецифическую активность и др. В связи с этим настоятельно рекомендуем при использовании эндонуклеаз рестрикции применять только прилагаемые к ним «фирменные» буферы. Это позволит добиться наилучших результатов при гидролизе ДНК. Каждой эндонуклеазе рестрикции «Ферментас» соответствует буфер, при использовании которого фермент проявляет 100% своей активности.

Все буферы должны храниться при -20°C. Буферы, в состав которых входит бычий сывороточный альбумин (БСА, BSA), выдерживают многократное размораживание-замораживание без выпадения этого белка в осадок.

Для разбавления эндонуклеаз рестрикции и их последующего хранения в течение длительного времени следует использовать буфер для разбавления и хранения ферментов. Эндонуклеазы рестрикции, изначально находящиеся в том же буфере, сохраняют свою активность после разбавления не менее 12 месяцев. Остальные эндонуклеазы рестрикции при разбавлении сохраняют более 50% активности в течение 3–4 недель при условии хранения при -20°C.

Эндонуклеазы, гидролизующие одну цепь ДНК (никазы)

Никаза (надрезающая эндонуклеаза) – это фермент, который в сайтах рестрикции режет только одну цепь двухцепочечной ДНК, в результате чего образуется надрез ДНК.
Никазы используют для создания зондов для флюоресцентной in situ гибридизации, блоттинга и других методов молекулярной биологии с помощью замены нуклеотидов в последовательности ДНК на нуклеотиды, мечеными флуоресцентной или радиоактивной меткой.

Эндонуклеазы генной конверсии (хоминг-эндонуклеазы, мегануклеазы)

Генная конверсия – замена нуклеотидной последовательности ДНК на гомологичную ей последовательностью нуклеотидов, который обычно инициируется формированием гибридной ДНК. Эндонуклеазы генной конверсии могут индуцировать такую гомологичную рекомбинацию последовательности ДНК в различных типах клеток. При этом моследовательности узнавания эндонуклеаз генной конверсии встречается крайне редко и могут быть закодированы как в структуре генов, кодирующих белки, так и в участках между генами.

Видео «FastDigest vs Стандартные рестриктазы»:

Полезные материалы:



Возврат к списку

Подпишитесь и получайте дополнительные скидки