Набор реагентов для выделения геномной ДНК из различных источников

Артикул: K0512

Производитель: Thermo Fisher Scientific

$141.73

Набор реагентов для выделения геномной ДНК из различных источников обеспечивает быстрое и эффективное выделение геномной ДНК высокой степени чистоты из цельной крови, сыворотки, клеточных линий, бактериальных клеток, тканей растений и млекопитающих, клеток эпителия (рис. 1). Принцип работы набора основан на селективном осаждении ДНК из неочищенного лизата с применением детергентов. Вся процедура занимает только 20-25 мин, позволяя получить, например, 2-10 мкг геномной ДНК из 0,2 мл крови. Выделенная ДНК большой молекулярной массы без дополнительной очистки может быть использована в молекулярно-биологических экспериментах, таких как гидролиз эндонуклеазами рестрикции, полимеразная цепная реакция, блот-гибридизация в варианте Саузерн, секвенирование и клонирование.

Состав набора

Компонент

K0512
100 экспериментов

Раствор для лизиса 40 мл
10-тикратный раствор для осаждения ДНК 8 мл
1,2 M раствор хлорида натрия 10 мл

К набору прилагается инструкция по его использованию.

Все компоненты набора протестированы в эксперименте по выделению геномной ДНК из 0,2 мл цельной крови. Полученная ДНК успешно использована при синтезе гена длиной 950 пар нуклеотидов методом ПЦР.

Условия хранения и использования набора.

Компоненты набора для выделения геномной ДНК из различных источников могут находиться при комнатной температуре.

Рис. 1. Геномная ДНК, выделенная с помощью набора K0512, из различных источников. Анализ методом электрофореза в 0,7%-ном агарозном геле образцов ДНК (дорожки с четными номерами) и продуктов их гидролиза эндонуклеазой рестрикции EcoRI (дорожки с нечетными номерами). М – маркер (ДНК фага лямбда после обработки эндонуклеазой рестрикции HindIII. ДНК, выделенная из крови человека (дорожки 1, 2), из лимфоцитов человека (дорожки 3, 4), из плаценты человека (дорожки 5, 6), из печени мыши (дорожки 7, 8), из тканей плюща обыкновенного (дорожки 9, 10), из клеток бактерии Haemophilus influenzae (дорожки 11, 12), из клеток бактерии E. coli (штамм ER2267, дорожки 13, 14), из клеток бактерии Bacillus subtilis (дорожки 15, 16).

Достоинства метода.

  • Эффективность – высокий выход очищенной геномной ДНК большой длины.
  • Скорость – процедура занимает около 20 мин после лизиса клеток.
  • Универсальность – применение для широкого спектра образцов.
  • Возможность варьировать количество выделяемой ДНК.
  • Безопасность – не требуется экстракция белков фенолом.

Рекомендации по подготовке образцов для выделения ДНК.

  • Цельную кровь необходимо отбирать в пробирки, содержащие ЭДТА или цитрат натрия, чтобы предотвратить свёртывание крови и деградацию ДНК.
    Внимание!
    ДНК, выделенная из образцов крови, не может быть использована далее в ПЦР. Обычно для выделения 2-10 мкг ДНК требуется 200 мкл свежей крови. Если необходимо получить большее количество ДНК, проводят лизис 500 мкл крови в 1 мл воды. Лейкоциты осаждают центрифугированием в течение 2 мин при 5000 оборотах/мин (~ 2500 х g). Осадок ресуспендируют в 200 мкл ТЕ-буфера (10 мМ Трис-HCl, pH 8,0, 1 мМ ЭДТА; не входит в состав набора). Образцы крови могут храниться при 2-4 ºС не более 2 месяцев. При необходимости более длительного хранения их следует разделить на порции по 200 мкл и держать при -20 ºС. Нельзя замораживать/размораживать образцы более одного раза. Важно следить за отсутствием в них сгустков крови. При работе с кровью необходимо соблюдать меры предосторожности.
  • Рекомендуется использовать свежие образцы сыворотки. При необходимости более длительного хранения их следует разделить на порции по 200 мкл и держать при -20 ºС.
  • Культуры клеток нужно осадить центрифугированием и ресуспендировать в 200 мкл ТЕ-буфера. Для эффективного отделения ДНК от других компонентов не следует брать более чем 0,4-0,6 х 106 клеток. Использование размороженных образцов не рекомендуется.
  • Эпителиальные клетки следует осадить центрифугированием, отобрать жидкость над осадком и ресуспендировать последний в 200 мкл ТЕ-буфера. Использование размороженных образцов не рекомендуется.
  • 25-30 мг ткани млекопитающего (свежей или замороженной до использования при -70 ºС) или 50-100 мг ткани растения необходимо поместить в жидкий азот и измельчить в ступке пестиком. Порошок помещают в пробирку для центрифугирования объемом 1,5 мл и ресуспендируют в 200 мкл ТЕ-буфера. Использование размороженных образцов не рекомендуется.
  • Бактериальные культуры нужно центрифугировать 10 мин при 5000 х g. 10-20 мг бактериальных клеток (свежих или замороженных до использования при -20 ºС) помещают в пробирку для центрифугирования объемом 1,5 мл и ресуспендируют в 200 мкл ТЕ-буфера. Использование размороженных клеток не рекомендуется.

Важная информация.
Следует избегать многократного замораживания/размораживания образцов, так как каждый цикл приводит к значительному уменьшению выхода интактной ДНК.

Методика проведения эксперимента.

  1. Смешать 200 мкл образца и 400 мкл раствора для лизиса, инкубировать при 65 ºС в течение 5 мин. При использовании замороженного образца раствор для лизиса должен быть добавлен до оттаивания первого. Далее образец инкубируют при 65 ºС в течение 10 мин при периодическом перемешивании путем переворачивания пробирки.
  2. Немедленно добавить 600 мкл хлороформа, осторожно перемешать эмульсию переворачиванием пробирки (3-5 раз), центрифугировать при 10000 оборотах/мин (~ 9400 х g) в течение 2 мин.
  3. Приготовить раствор для осаждения ДНК. Для этого смешать 720 мкл стерильной деионизированной воды с 80 мкл 10-тикратного раствора для осаждения ДНК, входящего в состав набора.
  4. Перенести верхнюю водную фазу, содержащую ДНК, в новую пробирку и добавить 800 мкл свежеприготовленного однократного раствора для осаждения ДНК. Перемешать при комнатной температуре в течение 1-2 мин, аккуратно переворачивая пробирку несколько раз, и центрифугировать при 10000 оборотах/мин (~ 9400 х g) в течение 2 мин.
  5. Максимально удалить жидкость над осадком (не сушить!). Добавить к осадку ДНК 100 мкл 1,2 M раствора хлорида натрия, перемешать на шейкере-встряхивателе типа «Vortex».
    Внимание!
    Убедиться в том, что осадок полностью растворился.
  6. Добавить 300 мкл холодного этанола, выдержать 10 мин при -20 ºС и центрифугировать 3-4 мин при 10000 оборотах/мин (~ 9400 х g). Удалить этанол. Промыть осадок один раз холодным 70%-ным водным раствором этанола и растворить ДНК в 100 мкл стерильной деионизированной воды, перемешивая на шейкере-встряхивателе типа «Vortex».
    Внимание!
    • Из-за низкого содержания ДНК, присутствующей в образцах сыворотки, рекомендуется увеличить время её осаждения до 1-20 ч при -20 ºС и уменьшить объем воды для растворения осадка до 20 мкл.
    • В случае последующего использования ДНК в ПЦР можно не промывать осадок холодным 70%-ным водным раствором этанола.
    • Если требуется получить геномную ДНК, не содержащую РНК, после выполнения стадии 5 протокола к раствору ДНК нужно добавить рибонуклеазу А (EN0531) до конечной концентрации 0,2 мг/мл, перемешать на шейкере-встряхивателе типа «Vortex» и инкубировать в течение 10 мин при 37 ºС.
  7. Измерить концентрацию ДНК спектрофотометрически или оценить визуально после электрофореза в агарозном геле. Убедиться в отсутствии РНК и оценить среднюю длину полученной ДНК. Обычно из 200 мкл свежей крови получают 2-10 мкг ДНК со средней длиной около 50 тысяч пар нуклеотидов.
    Внимание!
    • В образцах крови выход ДНК зависит от количества лейкоцитов.
    • Вирусные ДНК из образцов сыворотки не видны в агарозном геле.
    • 1-5 мкл раствора ДНК, выделенной с помощью набора K0512, достаточно для проведения ПЦР в смеси объемом 50 мкл.

 

Дополнительная информация о наборе для выделения геномной ДНК из различных источников доступна на сайте производителя.

Здесь вы можете увидеть расходные материалы для данного оборудования

Здесь вы можете увидеть комплектующие для данного оборудования

Модификации

Описание

Артикул

Цена

Кол-во

Сумма

Набор реагентов для выделения геномной ДНК из различных источников

K0512

$141.73

$0

Итого: $0

Заказать