Смесь для проведения ПЦР Phusion Blood Direct Master Mix (2X)

Артикул: F175S

Производитель: Thermo Fisher Scientific

Цена в валюте / в рублях

Фасовка:

$88.04

5 809.79 р.

Смесь Phusion Blood Direct Master предназначена для проведения ПЦР и амплификации как геномной, так и экзогенной ДНК с использованием в качестве исходного материала непосредственно образцов цельной крови. Для проведения ПЦР не требуется предварительного выделения ДНК. В реакции могут быть использованы образцы крови различных организмов, хранившиеся при +4°С, замороженные или высушенные на коммерчески доступных подложках, таких как Whatman® 903 и FTA®.

Смесь Phusion Blood Direct Master оптимизирована для получения ДНК-ампликонов длиной до 7500 пар нуклеотидов из образцов крови млекопитающих. Однако возможно использование крови птиц и других организмов. Рекомендуемая концентрация крови в реакционной смеси – 1-20%, допустимая – до 40%.

В упаковку входят:

Компонент F-175S
100 реакций
F-175L
500 реакций
Смесь для проведения ПЦР Phusion Blood Direct Master (2X) 1 мл 5 х 1 мл
50 мМ водный раствор ЭДТА (рН 8,0) 0,5 мл 0,5 мл
50 мМ водный раствор MgCl2 1,5 мл 1,5 мл
100%-ный диметилсульфоксид (ДМСО) 0,5 мл 0,5 мл
Смесь праймеров (25 мкМ раствор каждого) для проведения контрольной ПЦР:
24-звенный праймер 1: 5'-AGCCCTTGGGGASTTGAATTGCTG-3'
гибр. 73,5°С, S = C или G)
27-звенный праймер 2: 5'-GCACTCCAGAGGACAGCRGTGTCAATA-3'
гибр. 72,2°С, если R = A; Тгибр. 75,3°С, если R = G)
40 мкл 40 мкл
Вода без примеси нуклеаз 1,25 мл 4 х 1,25 мл
ДНК-маркер O'GeneRuler™ для экспресс-анализа (SM1563) 100 экспериментов (50 мкг)

Смесь Phusion Blood Direct Master представляет собой двукратный буферный раствор, содержащий ДНК-полимеразу Phusion Blood II (модифицированная высокоточная ДНК-полимераза Phusion Hot Start II), и каждый из дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (dATP, dCTP, dTTP, dGTP). Финальная концентрация MgCl2 в реакционной смеси – 3,0 мМ. В состав смеси также входят реагент для поддержания плотности раствора и два красителя, позволяющие детектировать продукты ПЦР в геле непосредственно после реакции. Красители не препятствуют эффективному протеканию ПЦР и дальнейшим манипуляциям с ДНК, таким как анализ нуклеотидной последовательности, лигирование и гидролиз эндонуклеазами рестрикции. Однако при анализе продуктов ПЦР методами УФ-спектроскопии или флуоресценции рекомендуется выделять целевой ДНК-фрагмент или использовать cмесь Phiusion Blood Direct (F-547).

Основной компонент смеси – ДНК-полимераза Phusion Blood II. Фермент характеризуется пониженной «чувствительностью» ко многим ингибиторам ПЦР, обнаруженным в крови. ДНК-полимераза Phusion Blood II содержит уникальный домен, увеличивающий процессивность, скорость и точность ее действия. Фермент катализирует синтез ДНК в направлении с 5'- на 3'-конец и обладает корректирующей 3'-5'-экзонуклеазной активностью. В процессе реакции образуются фрагменты ДНК с «тупыми» концами. Скорость появления ошибок в ПЦР с участием ДНК-полимеразы Phusion Blood II примерно в 25 раз ниже, чем в случае ДНК-полимеразы Thermus aquaticus.

Кроме области, ответственной за полимеразную активность, ДНК-полимераза Phusion Blood II имеет обратимо связанный с ней специфический белок Affibody® (Nord et al., Nature Biotechnology, 1997, v. 15, p. 772-777). Белок Affibody® ингибирует синтез ДНК-фрагментов полимеразой и ее 3'-5'-корректирующую активность при температуре окружающей среды, что предотвращает образование неспецифических продуктов, деградацию матрицы и праймеров. При повышенной температуре происходит диссоциация белка Affibody® из комплекса с ДНК-полимеразой Phusion Hot Start II, приводя к полному восстановлению полимеразной активности фермента без каких-либо дополнительных стадий в процессе ПЦР.

Условия хранения: -20°С. После размораживания буфер для разбавления можно также хранить при +4°С.

Рекомендации для проведения ПЦР.

  • Все растворы после размораживания тщательно перемешать и осадить капли центрифугированием;
  • При подготовке смеси для проведения ПЦР (табл. 1) не требуется помещать пробирки в баню со льдом;
  • Рекомендуется начинать эксперимент с добавления образца крови из расчета 5% от объема реакционной смеси без каких либо модификаций.

Таблица 1. Состав смеси для проведения ПЦР.

Компонент   Объем смеси Финальная концентрация
50 мкл 20 мкл
Н2O добавить до 50 мкл добавить до 20 мкл
Смесь для проведения ПЦР Phusion Blood Direct Master (2X) 25 мкл 10 мкл
Праймер А х мкл х мкл 0,5 мкМ
Праймер В х мкл х мкл 0,5 мкМ
Цельная кровь 2,5 мкл 1 мкл

Для оптимизации условий ПЦР в упаковке присутствует 50 мМ водный раствор MgCl2 (позволяет увеличить концентрацию ионов магния в реакционной смеси), 50 мМ водный раствор ЭДТА (рН 8,0) для уменьшения концентрации ионов магния в реакционной смеси и 100%-ный диметилсульфоксид. ДМСО (1-5%) рекомендуется добавлять в реакционную смесь при синтезе ДНК-фрагментов с высоким содержанием GC-пар. Содержание в реакционной смеси ДМСО понижает температуру гибридизации праймеров (10% ДМСО – на 5,5-6,0°С). Температура плавления ДМСО – 18-19°С.

Внимание! Условия проведения ПЦР с участием ДНК-полимеразы Phusion Blood II отличаются от протокола ПЦР с использованием стандартных ДНК-полимераз (табл. 2). Денатурацию проводят при 98°С. Время первоначальной денатурации увеличивают до 5 мин для лизиса лейкоцитов и высвобождения геномной ДНК. Для определения оптимальной температуры гидридизации праймеров следует пользоваться инструкцией и калькулятором, размещенными на сайте www.thermoscientific.com/pcrwebtools.

Для оптимизации протокола рекомендуется проведение контрольной ПЦР с прилагаемыми универсальными праймерами, которые позволяют амплифицировать 237-звенный фрагмент высококонсервативного участка геномной ДНК млекопитающих.

Таблица 2. Рекомендуемые условия ПЦР.

Этап   Двухстадийный протокол Трехстадийный протокол Количество циклов
Температура,°С Время Температура,°С Время
Первоначальная денатурация 98 5 мин 98 5 мин 1
Денатурация 98 5 с 98 5 с 35–40
Гибридизация праймеров x 5 с
Элонгация 72 15-30 с на 1000 нуклеотидных звеньев 72 15-30 с на 1000 нуклеотидных звеньев
Финальная элонгация 72
4
1 мин 72
4
1 мин 1

После амплификации рекомендуется центрифугировать реакционную смесь 1–3 мин при 4000 об./мин для осаждения клеточного дебриса и подготовки пробы для анализа методом гель-электрофореза.

Модификации

Описание

Артикул

Цена

Кол-во

Сумма

Смесь для проведения ПЦР Phusion Blood Direct Master Mix (2X)

F175L

$384.17 25 351.49 р. 25 351.49 р. 384.17 25351.493551 25351.493551 RUB

$0

0 р.
Смесь для проведения ПЦР Phusion Blood Direct Master Mix (2X)

F175S

$88.04 5 809.79 р. 5 809.79 р. 88.04 5809.786012 5809.786012 RUB

$0

0 р.

Итого: $0

0 р. Заказать

Здесь вы можете увидеть расходные материалы для данного оборудования

Здесь вы можете увидеть комплектующие для данного оборудования