Смесь для проведения ПЦР Phire Tissue Direct Master Mix (2X)

Артикул: F170S

Производитель: Thermo Fisher Scientific

Цена в валюте / в рублях

Фасовка:

$146.90

9 693.98 р.

Смесь Phire Tissue Direct Master предназначена для проведения ПЦР с использованием в качестве исходного материала непосредственно образцов тканей мыши, человека, рыб, птиц и насекомых. Для проведения ПЦР не требуется предварительного выделения ДНК.

В упаковку входят:

Компонент F-170S
100 реакций
F-170L
500 реакций
Смесь для проведения ПЦР Phire Tissue Direct Master (2X) 2 х 1,25 мл 10 х 1,25 мл
Буфер для разбавления 5 мл 2 х 12,5 мл
Добавка для извлечения ДНК из клеточного дебриса 3 х 100 мкл 1,3 мл
Смесь праймеров (25 мкМ раствор каждого) для проведения контрольной ПЦР:
24-звенный праймер 1: 5'-AGCCCTTGGGGASTTGAATTGCTG-3'
гибр. 73,5°С, S = C или G)
27-звенный праймер 2: 5'-GCACTCCAGAGGACAGCRGTGTCAATA-3'
гибр. 72,2°С, если R = A; Тгибр. 75,3 °С, если R = G)
40 мкл 40 мкл
Вода без примеси нуклеаз 2 х 1,25 мл 10 х 1,25 мл
ДНК-маркер O'GeneRuler™ для экспресс-анализа (SM1563) 100 экспериментов (50 мкг)

Смесь Phire Tissue Direct Master представляет собой двукратный буферный раствор, содержащий термостабильную ДНК-полимеразу Phire Hot Start II (F-122S, F-122L) и каждый из дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (dATP, dCTP, dTTP, dGTP). Финальная концентрация MgCl2 в реакционной смеси – 1,5 мМ. В состав смеси также входят реагент для поддержания плотности раствора и два красителя, позволяющие детектировать продукты ПЦР в геле непосредственно после реакции. Красители не препятствуют эффективному протеканию ПЦР и дальнейшим манипуляциям с ДНК, таким как анализ нуклеотидной последовательности, лигирование и гидролиз эндонуклеазами рестрикции. Однако при анализе продуктов ПЦР методами УФ-спектроскопии или флуоресценции рекомендуется выделять целевой ДНК-фрагмент или использовать cмесь Phire Animal Tissue Direct (F-140) или Phusion Human Specimen Direct (F-150) в зависимости от образца.

Основной компонент смеси - ДНК-полимераза Phire Hot Start II. Фермент характеризуется пониженной «чувствительностью» ко многим ингибиторам ПЦР, обнаруженным в тканях животных (например, коллаген, меланин и эумеланин в волосах и коже, миоглобин в мышцах). Он значительно эффективнее Taq-полимераз, используемых в ПЦР с «горячим стартом» (скорость элонгации цепи ДНК - 10-15 с на 1000 пар нуклеотидов), обладает в 2 раза более высокой точностью действия по сравнению с ними, стабилен, способен амплифицировать протяженные ДНК-фрагменты (до 7,5 пар нуклеотидов) с высоким выходом. Перечисленные свойства ДНК-полимеразы Phire Hot Start II обеспечиваются специально введенным в ее состав уникальным доменом, способным связывать двуцепочечную ДНК и увеличивающим процессивность действия фермента.

Термостабильная ДНК-полимераза Phire Hot Start II обладает незначительной корректирующей 3'-5'-экзонуклеазной активностью и не проявляет свойств 5'-3'-экзонуклеазы. В процессе реакции образуются фрагменты ДНК с «тупыми» концами.

Добавка для извлечения ДНК из клеточного дебриса необходима при проведении ПЦР с использованием непосредственно ткани (прямой протокол) для освобождения продуктов реакции от остатков клеток, которые не позволяют фрагментам ДНК «войти» в агарозный гель в процессе электрофоретического анализа.

Буфер для разбавления в сочетании с добавкой для извлечения ДНК из клеточного дебриса предназначен для обработки различных образцов тканей, в случаях, когда выполнение ПЦР без этой процедуры невозможно, когда требуется проведение мультиплексной ПЦР одного образца, амплификация длинных фрагментов ДНК, выполнение повторных исследовании, работа с новым материалом или используется новая пара праймеров.

Условия хранения: -20°С. После размораживания буфер для разбавления можно также хранить при +4°С.

Рекомендации для проведения ПЦР.

  • Все растворы после размораживания тщательно перемешать и осадить капли центрифугированием;
  • При подготовке смеси для проведения ПЦР (табл. 1) не требуется помещать пробирки в баню со льдом;
  • Следует помнить, что образец растения добавляется в пробирку с реакционной смесью последним.

Таблица 1. Состав смеси для проведения ПЦР.

Компонент   Объем смеси Финальная концентрация
50 мкл 20 мкл
Н2O добавить до 50 мкл добавить до 20 мкл
Смесь для проведения ПЦР Phire Tissue Direct Master (2X) 25 мкл 10 мкл
Праймер А х мкл х мкл 0,5 мкМ
Праймер В х мкл х мкл 0,5 мкМ
Образец (прямой протокол) диск диаметром 0,5 мм или маленький кусок ткани. Количество зависит от типа образца.
Образец (протокол с использованием буфера для разбавления) 2,5 мкл 0,5–1 мкл

Внимание! Условия проведения ПЦР с участием ДНК-полимеразы Phire Hot Start II отличаются от протокола ПЦР с использованием стандартных ДНК-полимераз (табл. 2). Денатурацию проводят при 98 °С. В прямом протоколе (рекомендуемый объем реакционной смеси – 50 мкл) время первоначальной денатурации увеличивают до 5 мин для лизиса клеток и высвобождения геномной ДНК. Для определения оптимальной температуры гидридизации праймеров следует пользоваться инструкцией и калькулятором, размещенными на сайте www.thermoscientific.com/pcrwebtools.

Для выбора протокола рекомендуется проведение контрольной ПЦР с прилагаемыми универсальными праймерами, которые позволяют амплифицировать 237-звенный фрагмент высококонсервативного участка геномной ДНК млекопитающих. Универсальные праймеры нельзя использовать при проведении ПЦР в случае образцов тканей рыб и насекомых.

Таблица 2. Рекомендуемые условия ПЦР.

Этап   Двухстадийный протокол Трехстадийный протокол Количество циклов
Температура,°С Время Температура,°С Время
Первоначальная денатурация 98 5 мин 98 5 мин 1
Денатурация 98 5 с 98 5 с 35–40
Гибридизация праймеров x 5 с
Элонгация 72 20 с для фрагментов ДНК менее 1000 нуклеотидных звеньев; 20 с на 1000 нуклеотидных звеньев для протяженных фрагментов 72 20 с для фрагментов ДНК менее 1000 нуклеотидных звеньев; 20 с на 1000 нуклеотидных звеньев для протяженных фрагментов
Финальная элонгация 72
4
1 мин 72
4
1 мин 1

Модификации

Описание

Артикул

Цена

Кол-во

Сумма

Смесь для проведения ПЦР Phire Tissue Direct Master Mix (2X)

F170L

$657.75 43 405.12 р. 43 405.12 р. 657.75 43405.119825 43405.119825 RUB

$0

0 р.
Смесь для проведения ПЦР Phire Tissue Direct Master Mix (2X)

F170S

$146.90 9 693.98 р. 9 693.98 р. 146.9 9693.97507 9693.97507 RUB

$0

0 р.

Итого: $0

0 р. Заказать

Здесь вы можете увидеть расходные материалы для данного оборудования

Здесь вы можете увидеть комплектующие для данного оборудования