Gateway-клонирование

Рекомбинантное клонирование Gateway

Рекомбинантное клонирование Gateway® — элегантный способ обойти трудности традиционного клонирования, позволяющий создать систему экспрессии с практически любыми параметрами. На данный момент опубликовано более 1 500 научных работ с участием технологии Gateway®.

Подробнее>>

Преимущества:

  • Доля целевых клонов – 99%;
  • Время реакции – 1 час при комнатной температуре;
  • Всегда правильная ориентация рамки считывания вставки;
  • Клонирование без эндонуклеаз обеспечивает целостность целевого гена;
  • Нет необходимости в ресеквенировании в процессе создания системы экспрессии;
  • Простой и надёжный механизм обмена вставками между векторами;
  • Масштабируемость – совместимость с высокопроизводительным скринингом.

Природный прототип технологии

Технология Gateway® базируется на хорошо изученном механизме интеграции фага λ в геном E.coli. После инфицирования участок attP ДНК фага рекомбинирует с участком attB ДНК E.coli. Сайт-специфическая рекомбинация проходит при участии интегразы фага (Int) и клеточного фактора интеграции (IHF). В результате реакции ДНК фага оказывается встроенной в геном бактерии и фланкирована сайтами attL и attR, каждый из которых содержит фрагменты attP и attB. Обратная реакция между attL и attR приводит к вырезанию ДНК фага и восстанавливает первоначальные сайты attP и attB.

Рекомбинация как инструмент клонирования

Реакция Gateway® BP – это реакция рекомбинации in vitro между двумя разными сайтами attB (attB1 и attB2) одной молекулы ДНК и двумя сайтами attP (attP1 и attP2) другой молекулы. В результате реакции между молекулами ДНК происходит обмен фрагментами, заключёнными между сайтами att с образованием сайтов attL1 и attL2 в одной молекуле и сайтов attR1 и attR2 – в другой. Стоит отметить, что сайт attB1 рекомбинирует с attP1 и не рекомбинирует с attP2 и т.д., поэтому после завершения реакции не образуется никаких нежелательных конструкций. Для получения исходных конструкций можно провести обратную реакцию Gateway® LR. Реакции BP и LR – основа клонирования Gateway®.

Этапы клонирования:

  • Создание исходного вектора – вектора, в котором целевой ген фланкирован сайтами att. Варианты:
    • использование специального вектора TOPO® с сайтами att;
    • клонирование продукта ПЦР, достроенного сайтами attB, в один из векторов pDONR™;
    • клонирование продукта ПЦР, достроенного сайтами рестрикции, в один из векторов pENTR™;
    • приобретение подходящего клона из коллекции Ultimate™ ORF.
  • Создание экспрессионного клона – сайт-специфическая рекомбинация между сайтами att в исходном и целевом векторах, трансформация и селекция E.coli.

Ниже представлена небольшая выборка наборов Gateway®. Ознакомиться с ассортиментом TOPO® более полно поможет Руководство по выбору векторов Life Technologies.

20 реакций

12537100

$5,378.96 351 749.02 р. 351 749.02 р.

 

K496000

$6,366.29 416 313.99 р. 416 313.99 р.

Вектор Gateway® pDEST™17

 

11803012

$1,481.78 96 898.78 р. 96 898.78 р.

 

11828029

$1,438.18 94 047.62 р. 94 047.62 р.