КОРЗИНА:

товаров 0
сумма 0 руб.


Бесплатная
горячая линия:
8 (800) 770-71-21

Контакты


Школа по репродуктивной генетике
г. Москва,

23–25.08.2017 г.
Подробнее>>

Проточная цитометрия
г. Челябинск
21–28.08.2017 г.
Подробнее>>

Future of Biomedicine 2017
г. Владивосток, остров Русский

10–15.09.2017 г.
Подробнее>>

Запиcь на курсы
в СПбГУ
сентябрь-октябрь 2017 г.
Подробнее>>


Высокоточная ДНК-полимераза Phusion

Концентрация фермента - 2 е.а./мкл.

В упаковку также входят:

  • 5X буфер Phusion HF;
  • 5X буфер Phusion GC;
  • 50 мМ раствор MgCl2;
  • 100%-ный диметилсульфоксид (ДМСО).

Термостабильная ДНК-полимераза Phusion представляет собой фермент, подобный ДНК-полимеразе Pyrococcus furiosus и содержащий домен, увеличивающий процессивность его действия. ДНК-полимеразу Phusion экспрессируют в клетках E. coli, несущих плазмиду с геном этого белка. Фермент катализирует синтез ДНК в направлении с 5'- на 3'-конец и обладает корректирующей 3'-5'-экзонуклеазной активностью. dUTP и dITP не являются субстратами ДНК-полимеразы Phusion, она не способна вести синтез ДНК при наличии этих модифицированных нуклеозидов в составе матрицы или праймера.

Фермент не содержит примесей эндо- и экзонуклеаз.

Термостабильная ДНК-полимераза Phusion демонстрирует экстремальную эффективность в полимеразной цепной реакции (ПЦР). Фермент катализирует синтез ДНК на длинных и сложных матрицах с высокой точностью. В процессе реакции образуются фрагменты геномных ДНК длиной около 7,5 тысяч пар нуклеотидов и фаговых ДНК длиной около 20 тысяч пар нуклеотидов с «тупыми» концами. Скорость появления ошибок в ПЦР с участием ДНК-полимеразы Phusion, оцененная модифицированным методом Фрея и Суппманна (Biochemica, 1995, v. 2, p. 34-35), составляет 4,4 х 10-7, что примерно в 50 раз ниже, чем в случае ДНК-полимеразы Thermus aquaticus и в 6 раз ниже, чем в случае ДНК-полимеразы Pyrococcus furiosus.

За единицу активности ДНК-полимеразы Phusion принимают количество фермента, необходимое для включения 10 нмоль дезоксирибонуклеотидов в ДНК-фрагмент за 30 мин при 74 °С в условиях стационарной кинетики. Исследование ферментативной активности проводят в 25 мМ буфере ТAPS-HCl (рН 9,3 при 25 °С), содержащем 50 мМ KCl, 2 мМ MgCl2, 1 мМ 2-меркаптоэтанол, 20 мкг активированной ДНК тимуса теленка, 100 мкМ раствор dCTP, 200 мкМ растворы dATP, dGTP,dTTP и 0,5 мкКи [альфа-32Р]dСTP.

Буфер для хранения ДНК-полимеразы Phusion:

20 мМ Трис-HCl (рН 7,4 при 25 °С), 100 мМ КCl, 1 мМ ДТТ, 0,1 мМ ЭДТА, стабилизаторы, 200 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, 50% глицерина.

Условия транспортировки – сухой лед, условия хранения: -20 °С.

5X буфер Phusion HF (F-518) и 5X буфер Phusion GC (F-519) содержат 7,5 мМ MgCl2, что обеспечивает оптимальную финальную концентрацию MgCl2 - 1,5 мМ - в реакционной смеси. В большинстве случаев для проведения высокоточной ПЦР рекомендуется использовать буфер Phusion HF. Буфер Phusion GC применяют при проведении ПЦР на длинных матрицах со сложной вторичной структурой и высоким содержанием GC-пар.

Для проведения ПЦР на микрочипах с участием ДНК-полимеразы Phusion возможно использование буферов без детергентов.

При синтезе ДНК-фрагментов длиной < 20 тысяч пар нуклеотидов с высоким содержанием GC-пар в реакционную смесь рекомендуется добавлять 3% диметилсульфоксида.

Внимание! Содержание в реакционной смеси ДМСО понижает температуру гибридизации праймеров (10% ДМСО – на 5,5-6,0 °С). Температура плавления ДМСО – 18-19 °С.

Рекомендации для проведения ПЦР.

  • Все растворы после размораживания тщательно перемешать и осадить капли центрифугированием;
  • Поместить пробирки для ПЦР в баню со льдом. Приготовить стоковую смесь, состоящую из воды, буфера, трифосфатов нуклеотидов, праймеров и матрицы (табл. 1). Оптимальная концентрация каждого из dNTP в реакционной смеси – 200 мкМ;
  • ДНК-полимераза Phusion добавляется в реакционную смесь последней. Поскольку фермент обладает корректирующей 3'-5'-экзонуклеазной активностью, возможна деградация праймеров. Не рекомендуется использовать больше 0,04 единиц активности (e.а.) полимеразы в расчете на 1 мкл реакционной смеси, особенно при синтезе фрагментов ДНК длиной > 5 тысяч пар нуклеотидов. Следует помнить, что ДНК-полимераза Phusion позволяет получать только фрагменты ДНК с «тупыми» концами.

Таблица 1. Состав смеси для проведения ПЦР.

Компонент

Объем смеси

Финальная концентрация

50 мкл

20 мкл

Н2О

добавить до 50 мкл

добавить до 20 мкл

 

5Х Буфер Phusion

10 мкл

4 мкл

10 мМ dNTP

1 мкл

0,4 мкл

200 мкМ каждого

Праймер А

х мкл

х мкл

0,5 мкМ

Праймер В

х мкл

х мкл

0,5 мкМ

ДНК-матрица*

х мкл

х мкл

 

(ДМСО, при необходимости)

(1,5 мкл)

(0,6 мкл)

(3%)

Полимераза Phusion

0,5 мкл

0,2 мкл

0,02 е.а./мкл

* Количество ДНК-матрицы при проведении ПЦР: 1 пг – 10 нг на 50 мкл реакционной смеси для плазмидных ДНК, ДНК фага лямбда или BAC ДНК; 50-250 нг - для геномных ДНК со сложной вторичной структурой; не более 10% смеси, содержащей кДНК, от конечного объема смеси для ПЦР.

Внимание! Условия проведения ПЦР с участием ДНК-полимеразы Phusion отличаются от протокола ПЦР с использованием стандартных ДНК-полимераз (табл. 2). Денатурацию проводят при 98 °С. Для определения оптимальной температуры гидридизации праймеров следует пользоваться инструкцией и калькулятором, размещенными на сайте www.thermoscientific.com/pcrwebtools. Эта температура может существенно отличаться от температуры гибридизации при проведении ПЦР с помощью Taq ДНК-полимеразы. Время элонгации не должно превышать 1 мин на 1000 нуклеотидных звеньев. Повышенная активность ДНК-полимеразы Phusion на стадиях денатурации и гибридизации связана с высокой ионной силой буферного раствора.

Таблица 2. Рекомендуемые условия ПЦР.


Этап

Двухстадийный протокол

Трехстадийный протокол

 

Количество циклов

Температура, °С

Время, с

Температура,
°С

Время, с

Первоначальная денатурация

98

30

98

30

1

Денатурация

98

5-10

98

5-10

 

25-35

Гибридизация праймеров

-

-

х

10-30

Элонгация

72

15-30 с на 1000 нуклеотидных звеньев

72

15-30 с на 1000 нуклеотидных звеньев

Финальная элонгация

72
4

5-10

72
4

5-10

1


Описание  Фасовка   Артикул  Цена Количество
Акция до 31.08.2017!
(базовая цена – $592,45)
 500 е.а.   F530L  $444,34
 
Акция до 31.08.2017!
(базовая цена – $135,12)
 100 е.а.   F530S  $101,34